化学发光的基本原理

化学发光检测依赖于某些反应底物在酶的催化下产生光子，这些光子无需激发光源即可发出，被仪器中的光电检测器（如光电倍增管PMT、CCD或CMOS）接收并转化为电信号。常见的化学发光体系包括：

• 辣根过氧化物酶（HRP）+ Luminol；

• 碱性磷酸酶（ALP）+ AMPPD底物；

• 亚硝基酶类的发光体系。

这些体系反应迅速，信号强度与目标分子浓度呈一定函数关系，具备高度灵敏、无激发背景干扰的优点。

三、仪器因素对灵敏度的制约作用

1. 光电检测器的类型与性能

酶标仪中常见的光电检测装置包括：

• 光电倍增管（PMT）：灵敏度高、噪声低，适合极低信号强度检测；

• 电荷耦合器件（CCD）：可用于成像型检测，适合同时读取多个孔位；

• 互补金属氧化物半导体（CMOS）：读数速度快，但低光强环境下噪声高于PMT。

PMT的量子效率（QE）和暗电流水平（dark current）决定其在暗光环境下的信噪比。高性能PMT能将单个光子放大至可测电流，提升低信号响应能力。而若检测器对弱光不敏感或噪声高，则会掩盖微弱发光信号，降低系统检测灵敏度。

2. 光学系统设计

化学发光不依赖激发光，但良好的光路仍决定信号收集效率。理想的光路设计应具备以下条件：

• 高透光率镜头与反射镜：确保微弱信号不被吸收或散射；

• 短路径、直达式通光结构：避免光在多面反射中耗散；

• 孔板适配结构优化：不同孔板（96、384、1536孔）对收光效率有差异。

若光路遮挡、透镜污染或镜面反光率不足，会削弱最终入射检测器的光信号，进而制约灵敏度。

3. 滤光片与信号干扰控制

虽然化学发光不需要激发滤光片，但仍需使用发光带通滤光片来控制杂散光进入检测器。高质量滤光片应具备：

• 极窄带宽（增强光谱选择性）；

• 高截止深度（抑制背景信号）；

• 低自发光（防止滤片发光干扰信号）。

劣质滤光片的透过率或截止率异常，会引入杂光，干扰真实信号，降低信噪比。

4. 孔板对信号的影响

不同孔板材质和颜色对信号采集有显著影响：

• 白孔板：表面高反射率，增强信号；

• 黑孔板：减少反射，适合荧光；

• 透明孔板：适合吸光度测定，发光性能差。

选错孔板类型（如用透明孔板做发光检测），将导致大量信号散失，严重降低检测下限。

四、实验条件与试剂因素的影响

1. 底物浓度与反应时间

底物是信号产生的来源，浓度控制必须适度：

• 过低底物量 → 发光反应不完全，信号弱；

• 过高底物量 → 噪声提高，非特异反应增加。

此外，底物反应类型决定读数时间策略：

• 闪光型反应（flash-type）：信号瞬发，应立即读数；

• 稳光型反应（glow-type）：信号持续，适合多孔读板。

未按发光反应类型设定读数窗口，极易错过发光峰值，影响灵敏度表现。

2. 酶活性与底物兼容性

酶标二抗的酶活性下降、储存不当或重复冻融，均会影响底物反应效率。同样，底物如果过期、被光或温度破坏，也会失活。在HRP体系中，Luminol需辅以增强剂（如P-iodophenol）才能获得高强度信号，缺乏助剂也会降低灵敏度。

3. pH和缓冲体系匹配

发光反应对反应环境高度敏感，常见的影响因素包括：

• 缓冲液pH值（HRP+Luminol最佳pH约为8.5）；

• 离子强度（NaCl浓度过高会抑制酶活）；

• 有机溶剂残留（如DMSO干扰反应平衡）；

实验中如不控制好环境参数，信号会不稳定，重现性差，检测灵敏度下降。

五、操作流程中的变量与人为因素

1. 洗板与残留污染

洗板是免疫反应中不可或缺的一环，影响非特异结合的清除程度。洗板不彻底将导致底物与非特异性结合酶反应，产生背景噪音。而洗板液中若残留高浓度Tween-20或含强氧化剂，也可能与发光底物反应，产生杂散信号。

2. 加样准确性与孔间一致性

孔间加样不均匀会使得信号强弱差异增大，尤其是在高灵敏度实验中更为明显。使用手工加样时更需注意操作的一致性，否则孔与孔之间的光子数量差异大，会掩盖真实趋势，影响信号区分度。

3. 孵育时间与温度控制

化学发光反应对温度波动极其敏感。在过冷或过热的条件下，酶活性、反应速率及底物稳定性均发生变化。理想温度通常维持在25°C或37°C，温差需控制在±0.5°C以内。实验中如未使用恒温孵育设备或操作过程中频繁开关盖，会造成信号波动。

六、数据采集与信号处理方式

1. 积分时间与增益设置

信号采集过程中的“积分时间”（integration time）设定决定仪器读取每个孔位的光子时间窗口。积分时间短则信号强度不足，长则背景信号积累。建议：

• 低信号样本 → 延长积分时间（如1–2秒）；

• 高信号样本 → 缩短时间避免饱和。

此外，PMT或CCD的“增益”（gain）需根据实验调整，否则会出现信号饱和（clipping）或噪声占比增大。

2. 背景校正与标准化处理

为提升灵敏度，需从每个读数中扣除背景值。这可通过：

• 使用空白孔设定系统本底；

• 每行设“背景参考孔”；

• 对样本数据进行归一化处理（如单位比值、Z-score）；

若不处理背景数据，微弱信号极易被背景掩盖。

3. 孔间串扰（Crosstalk）控制

化学发光中信号强度可能高达10⁶计数单位，邻近孔间存在显著串扰风险，影响弱信号准确度。控制措施包括：

• 使用高遮光白孔板；

• 交错布置高低浓度样本；

• 启用仪器自带的串扰校正算法。

七、外部环境与耗材对灵敏度的影响

1. 室内光干扰

尽管化学发光在暗箱内进行，但若仪器密封性差或读板前开盖时间过长，环境光（尤其荧光灯）将混入，抬高背景噪声。

2. 孔板质量与光学均匀性

不同品牌孔板的表面处理、孔壁光洁度等会影响光反射与透射性能。廉价孔板透光性差、孔间一致性差，会引发信号漂移，应优先选用高灵敏度专用板。

3. 读板顺序与发光衰减匹配

化学发光信号往往随时间快速衰减，若使用线性顺序读板（从A1开始逐孔扫描），最后一孔可能与第一孔相隔90秒以上，信号已下降。此时需选择：

• 快速读板模式；

• 同步加样与自动同步读数；

• 排序优化（如按Z型读板）；

以保证所有孔位读数的时间一致性，防止时差导致灵敏度偏低。

八、灵敏度优化策略总结

九、结语

化学发光是一种极具潜力的光学检测方式，其超高灵敏度决定了其在分子诊断、蛋白分析与免疫检测中的广泛应用。然而，灵敏度的真正发挥，不仅仅依赖于仪器的设计与规格，更需要使用者在试剂选择、实验细节、操作规范等方面精益求精。只有全方位把控各类变量，才能在微弱信号中精准捕捉目标，实现低至皮摩尔、飞摩尔级别的检测需求。展望未来，随着光电技术、材料科学与数据分析的进一步发展，酶标仪的化学发光检测灵敏度仍将不断攀升，推动生命科学研究迈向更高层次。