一、酶标仪校准的定义与作用

1.1 什么是校准？

校准（Calibration）是指用已知标准的参考设备或标准物质，对酶标仪各检测通道的读数准确性进行验证和调整的过程。其目的是确保仪器在实际使用中提供的数据与真实值之间的偏差处于可接受范围内。

1.2 校准的目的

• 确保读数精度和重复性；

• 防止检测漂移导致假阴性/假阳性；

• 符合国家法规和实验室质量管理体系要求；

• 提供可追溯的数据审计记录；

• 延长仪器寿命，预防潜在故障。

1.3 校准类型

• 初始校准：新仪器首次启用前必须进行；

• 定期校准：按固定周期执行；

• 异常校准：设备搬运、维修、更换配件、检测异常后立即执行；

• 软件升级或检测模式变更后校准：确保新设置下结果可靠。

二、酶标仪主要检测模式介绍

1. 吸光度检测模式（Absorbance/OD）
   通过测量样品对特定波长光的吸收强度（光密度）来间接反映样品浓度或反应程度。典型波长为450 nm、570 nm、620 nm等。

2. 荧光检测模式（Fluorescence）
   通过激发光照射样本，引发其发射荧光，然后检测荧光强度。适用于高灵敏度实验，如DNA染料定量、细胞标记物检测。

3. 化学发光检测模式（Luminescence）
   利用底物在酶促作用下自发发光，不需要外部激光源。用于超高灵敏检测，如免疫发光、生物发光报告基因实验。

4. 扫描波长模式（Spectrum Scan）
   可在一定波长区间内扫描样品，绘制吸收/发射光谱曲线，广泛用于未知物质波长选择和谱图分析。

三、不同检测模式的校准频率建议

3.1 吸光度模式校准频率建议

原理简述

基于比尔-朗伯定律，测量样品对特定波长光的吸收程度。酶标仪中最常见的检测模式，适用于ELISA、比色分析等。

推荐校准频率

• 日常自检（用户级）：每日使用前，通过内置标准滤光片或空白孔对波长和基线进行自检。

• 标准曲线校准（应用级）：每次实验前使用标准品或比色板（校准片）测试线性响应，确保各波长通道精度正常。

• 定期校准（维护级）：每1–3个月使用NIST溯源的OD校准板（如450 nm标准板）或液体标准进行精度校准。

• 年度认证校准（计量认证级）：每年1次委托具有资质的第三方机构进行全波段线性、重复性、漂移测试。

特别提示

高通量实验室建议增加频次，如每月一次硬件层校准。使用频繁或环境温湿度波动大时，也需适当缩短周期。

3.2 荧光检测模式校准频率建议

原理简述

样品在特定激发波长下发射荧光信号，仪器检测其强度。检测灵敏度高，对环境光、器件温度等因素较敏感。

推荐校准频率

• 每周通道自检：使用荧光参考标准液（如FITC、Cy3标品）进行激发-发射响应测试，确认增益值稳定。

• 每月灵敏度验证：检测已知浓度系列的荧光标准溶液，评估灵敏度线性和LOD（最低检测限）是否一致。

• 半年完整校准：检查滤光片透过率、激发源光强、PMT响应等关键参数，必要时更换衰减元件。

• 年度校准（推荐）：使用经认证的荧光标准板进行全通道灵敏度、漂移率与增益一致性测试。

特别提示

如进行细胞活力检测或基因表达分析等高灵敏实验，推荐每周一次应用校准；使用强光源或高增益通道时，应监测光源老化状态。

3.3 发光检测模式校准频率建议

原理简述

通过酶促或生化反应释放的光子直接被光电倍增管（PMT）捕获。无激发光源，依赖暗计数控制。

推荐校准频率

• 每日自检测试：使用内置暗电流基准，检测背景噪声与灵敏度稳定性。

• 每周发光参考测试：检测已知强度的发光标准液（如稳定发光底物），对比灵敏度与响应速度。

• 每3个月完整光电系统检查：评估PMT响应线性、动态范围、噪声抑制等性能。

• 年度计量校准：推荐使用国际认证发光标准液，对比信号强度及漂移，输出定量性能报告。

特别提示

因发光系统极易受到温度、电压干扰，建议安装不间断电源（UPS），并配置冷却风道以延长PMT寿命。

3.4 波长扫描与多波段检测模式校准频率建议

原理简述

利用单色器或滤光轮进行多个波长段扫描，获取完整谱图或多波段OD值。用于未知物质波峰分析、特征吸收波长选择等。

推荐校准频率

• 首次使用前波长确认：利用波长校准标准板（如钕玻璃片）检测仪器实际发射波长偏差。

• 每月扫描精度测试：使用已知吸收峰的标准物质（如甲苯、苯胺蓝）扫描吸收峰位，检查波长偏移量是否≤±2 nm。

• 每6个月扫描线性测试：在多个波长下测定OD值响应一致性，确认通道间无畸变。

• 每年全通道校准：通过多波长标准玻璃板，确认仪器响应曲线和每个波段的检测灵敏度、分辨率、线性范围。

特别提示

扫描模块如含有可变光栅、移动透镜等机械部件，建议每半年检查一次对准精度与机械噪声影响。

四、影响校准频率的关键因素分析

4.1 使用频率

设备使用频率越高，组件老化越快，性能漂移越明显，应相应提高校准频次。例如，每天检测数十块96孔板的高通量平台，建议月度执行全功能校准。

4.2 检测模式的敏感性

化学发光、荧光检测等模式对光源、背景噪声敏感，校准周期应短于吸光度模式，尤其在临床级别诊断中应提高校准频率。

4.3 环境条件

仪器长期运行在高温、高湿、强电磁干扰或粉尘环境中，会加速传感器和光学组件老化，建议适当缩短校准周期。

4.4 实验项目风险等级

用于疫苗开发、生物等效性评价、临床前研究等高风险实验的设备，需按照GLP/GMP等规范制定更严苛的校准策略。

五、合规性与质量管理建议

5.1 符合ISO与GxP标准

依据ISO 17025、ISO 9001、ISO 13485等标准，校准记录必须包含校准项目、校准方法、使用标准品信息、操作人员、校准结果及偏差范围说明。校准记录至少保留5年以供审计。

5.2 建立设备校准计划

建议实验室建立年度设备校准计划，并设定自动提醒机制（如LIMS系统中添加校准到期提醒），避免漏校、错校。

5.3 使用溯源标准物质

所有用于校准的标准液、标准板、光强检测器等应具备NIST、国家计量院或第三方认证的校准证书，确保数据可追溯性。

5.4 多层次校准策略

可将日常自检、月度性能校准与年度认证校准结合起来，形成由用户、工程师和第三方认证机构共同参与的三重保障机制。

六、总结与建议

酶标仪各检测模式因其技术原理、精度要求与应用差异，在校准策略与周期设定上应差别化对待。吸光度模式可采用季度级别校准，荧光与发光模式则建议按周或月度检查灵敏度，波长扫描模式则应关注光谱精度与线性响应。

建议实验室结合自身仪器品牌型号、实验类型、使用频率及合规需求，制定科学的校准周期与操作流程，建立完整的校准档案管理体系。通过数据记录分析，还可持续优化设备使用与保养策略，提高实验效率与数据可信度。