酶标仪零点校准与跨度校准的区别及其实际意义

一、引言

酶标仪（Microplate Reader）是生物医学实验室中常见的检测设备，主要用于微孔板上样本的光学测量，如吸光度（光密度，OD）、荧光或发光等。其核心在于通过检测孔内光强度的变化来判断样本浓度、酶活性等指标。在实际使用中，酶标仪的测量精度与其光学系统校准状态密切相关，尤其是“零点校准”（Zero Calibration）与“跨度校准”（Span Calibration，也称斜率校准）的质量直接影响检测数据的准确性和重现性。

尽管这两种校准方式常常出现在用户手册中，但很多实验人员在实际操作中仍对它们的含义、作用及应用场景存在混淆。本文将围绕零点校准与跨度校准的概念、原理、差异、操作流程以及维护建议进行全面探讨，帮助读者科学理解与正确使用这两个关键校准方法。

二、酶标仪的光学原理与校准需求

酶标仪利用光学系统通过发射光源、样本吸收、剩余光强接收等步骤，测量样本对特定波长光的吸收程度，从而反推出溶液中的物质浓度。其核心检测公式基于比尔-朗伯定律：

A=log⁡10(I0I)=ϵclA = \log_{10} \left(\frac{I_0}{I}\right) = \epsilon c lA=log10(II0)=ϵcl

其中：

• $A$ 是吸光度；

• I0I_0I0 是入射光强；

• $I$ 是透过样本后的光强；

• $ϵ$ 是摩尔吸光系数；

• $c$ 是溶液浓度；

• $l$ 是光程长度。

然而，酶标仪光电检测系统在长期运行后，可能因光源老化、滤光片偏移、探测器灵敏度变化等原因，导致系统读数偏离真实值。因此，定期进行零点与跨度校准，可确保测量值符合标准，提高数据的可比性和溯源性。

三、零点校准（Zero Calibration）

3.1 定义

零点校准是指将仪器的检测系统校正到在无光吸收（即样品吸光度应为零）的条件下，其读数归零的过程。简单来说，它是对“背景”或“空白”读数进行校正，使仪器读数起点准确。

3.2 原理说明

在理论上，当样本孔中装有纯净溶液（如双蒸水、空白缓冲液），其应对特定波长的光几乎没有吸收，即 $A\approx 0$。但在实际使用中，由于探测器暗电流、光源初始强度波动或光路杂散光等干扰，即使无样本吸收，仪器也可能显示非零值。零点校准即是用此空白样品进行“基线归零”操作，将系统中不属于样本吸收造成的信号剔除掉。

3.3 操作流程

1. 准备一块干净的微孔板；

2. 在若干孔中加入适量空白溶液（与实验试剂匹配的缓冲液或纯水）；

3. 设定酶标仪校准模式为“零点校准”；

4. 系统读取空白孔吸光度并设为校准基线；

5. 校准后，所有吸光度测量值将以该基线为参考计算。

3.4 应用意义

• 消除仪器本身引入的背景偏差；

• 提高低吸光度样本（如OD<0.1）的测量准确性；

• 校正因换灯或更换滤光片后产生的系统漂移；

• 提供统一的读数基准，方便数据比较。

3.5 常见误区

• 将空气读取值作为零点校准：应避免此做法，因为空气中仍有杂散光且光程不同，影响精度；

• 长时间不进行零点校准：尤其在光源使用寿命临近时，未校准容易产生整体偏移。

四、跨度校准（Span Calibration）

4.1 定义

跨度校准是通过使用一个或多个已知吸光度值的标准物质，对仪器的线性范围内的斜率（响应系数）进行校正的过程。其目的是确保在整个测量区间内，酶标仪输出的吸光度值与真实值成线性对应关系。

4.2 原理说明

假设理想情况下，仪器输出读数与样本浓度间的函数关系为 $y=kx+b$，其中 $k$ 为斜率，$b$ 为截距（即零点）。跨度校准就是根据已知标准溶液的实际吸光度值（如OD=1.0、OD=2.0），反推出仪器读数与真实值间的映射关系，并调整软件或硬件参数，使其在整个线性范围内的响应一致。

4.3 操作流程

1. 准备多个已知浓度的标准溶液，分别具有代表性的吸光度值（如0.2、1.0、2.0等）；

2. 分别加入微孔板中，设定酶标仪进入“跨度校准”模式；

3. 仪器读取每个标准溶液的当前吸光度值，并与标准值进行比对；

4. 系统自动计算线性回归方程，并调整仪器内部斜率参数；

5. 校准完成后，对所有读数按新斜率输出。

4.4 应用意义

• 保证仪器在整个测量区间内的线性响应；

• 修正探测器灵敏度变化或光学路径差异；

• 确保高吸光度样本（如OD > 1.5）的精度；

• 提高定量分析中标准曲线的准确性。

4.5 常见误区

• 使用未经验证的标准物质：会导致斜率计算错误，影响所有数据；

• 忽视定期跨度校准：长时间使用后，检测系统灵敏度可能下降，从而影响检测曲线线性；

• 误将跨度校准等同于浓度曲线建立：跨度校准是仪器级别的响应校正，而浓度曲线是样本级定量工具，二者目的不同。

五、零点校准与跨度校准的差异对比

六、实际应用举例

6.1 ELISA 检测前的准备

在使用ELISA检测试剂盒进行临床样本分析前，建议用户按如下顺序进行：

1. 零点校准

• 使用试剂盒提供的空白孔（如样本稀释液），执行零点校准，确保仪器基线设为零。

2. 跨度校准

• 使用标准品（如已知抗原浓度的溶液），进行跨度校准。若厂商已提供校准数据，也可跳过此步。

3. 检测并绘制标准曲线

• 在已校准状态下读取标准品吸光度，绘制标准曲线。此时曲线斜率和起点皆与真实浓度高度匹配，确保浓度反推准确。

6.2 仪器维护后的性能验证

若酶标仪更换了光源或光学组件，应立即执行零点与跨度校准，并与以往测试记录对比，确认响应特性未发生显著漂移。此举有助于维持长期实验数据的一致性与可比性。

七、常见问题解答

问：是否可以只做零点校准而跳过跨度校准？

答：不建议。零点校准只能保证基线读数为零，若仪器响应线性失准，仅做零点校准无法恢复整体读数准确性。特别是高浓度样本的读数仍可能偏离。

问：跨度校准后是否还需要标准曲线？

答：需要。跨度校准是仪器内部校正，标准曲线则是样本数据与浓度的映射关系，是定量分析必不可少的一部分。校准保证读数准确，曲线实现浓度推算。

问：零点或跨度校准是否可由软件自动完成？

答：部分高端酶标仪确实配备自动校准程序，可通过内置标准光源或外接比色滤光片实现，但仍需人工确认样本是否放置正确。自动校准提升效率，但仍需定期人工验证。

八、维护建议与实验室标准操作程序（SOP）

为确保酶标仪在长期使用中保持优良性能，建议建立如下校准与维护制度：

8.1 校准周期建议

• 每日或每次实验前：进行零点校准；

• 每月一次：进行跨度校准；

• 每次维修或更换灯泡、滤光片后：必须执行零点与跨度校准；

• 每季度：使用外部标准比色片进行校准验证（非液体标准）；

• 每年：联系厂家或认证机构进行一次全系统计量校验。

8.2 校准记录与文件保存

• 建议以纸质或电子记录方式保存每次校准过程、日期、操作人、原始读数与校准后结果；

• 校准记录应保存至少2年，满足GMP、GLP或ISO 17025等法规要求；

• 建议设立质量管理员进行抽检，确保操作符合SOP流程。

九、总结与建议

零点校准和跨度校准虽然都是校正酶标仪测量误差的方法，但二者作用机制、操作方式与应用意义截然不同。零点校准解决的是基线偏移问题，主要影响低OD样本的检测结果；而跨度校准则针对的是响应比例，直接关系到高OD样本和定量分析的准确性。

在实际操作中，应将这两种校准结合起来，通过制定标准化操作流程，确保酶标仪在任何使用场景下都处于最优检测状态。实验室应配备标准物质或比色滤片，并培养具备基本校准技能的技术人员，保障实验数据的可靠性、可比性与合规性。

正确理解和合理执行零点与跨度校准，不仅是仪器维护的重要组成部分，更是确保科研质量、临床诊断准确性和数据法规合规的基础。