酶标仪校准需用哪些校准板或标准品？
校准是指使用已知性能的标准品或校准板，对酶标仪的读数系统、光学系统、机械系统等进行比对与调整的过程。不同检测模式（如吸光度、荧光、化学发光）使用不同类型的标准材料与校准方法，且对应的校准周期、操作流程也各不相同。
一、酶标仪校准的意义与分类
1.1 为什么需要校准？
酶标仪经过长期使用，其光源强度、探测器灵敏度、滤光片透光率、孔板定位精度等因素都会出现漂移。若不进行定期校准，易出现以下问题：
吸光度偏差：读数偏高或偏低，影响浓度计算；
荧光串扰：检测窗口中心偏移，导致信号交叉；
光学信噪比下降：误差增大，实验重复性下降；
标准曲线异常：实验数据失真；
仪器比对失效：无法与其他实验室标准统一。
1.2 校准的常见类型
按照检测模式分类，酶标仪的校准主要包括以下几类：
吸光度校准（Absorbance Calibration）
荧光强度校准（Fluorescence Calibration）
化学发光校准（Luminescence Calibration）
光路对准与孔位定位校准（Alignment Calibration）
波长准确性校准（Wavelength Calibration）
光程补偿功能校准（Pathlength Calibration）
二、吸光度校准用校准板与标准品
2.1 吸光度校准的目的
校验酶标仪在特定波长（如 450 nm, 620 nm, 630 nm）下是否能准确读取不同吸光度值；
判断光源、滤光片、探测器是否衰退；
为仪器提供吸光度对照标准曲线。
2.2 常用标准品与校准板
（1）NIST 溯源吸光度标准板（NIST Traceable Optical Density Plate）
通常为96孔聚苯乙烯材质的透明板；
每个孔含有光学密度已知的彩色物质（如铬酸盐、染料树脂）；
每个孔的吸光度值在固定波长下有精确标注；
适用于波长 405 nm、450 nm、490 nm、620 nm、650 nm 等。
用途：快速评估吸光度准确性与线性范围，通常用于日常性能验证（PV）。
（2）液体比色标准液（Absorbance Standard Solutions）
例如铬酸钾溶液（在 450 nm 有特征吸收峰）；
市售如 Thermo、Sigma、Merck 提供的校准液；
实验者可自制已知浓度的核酸/蛋白标准曲线溶液。
用途：模拟真实实验条件下进行路径长补偿、溶液体积误差评估等。
（3）玻璃比色滤光片或参考吸光比色皿
使用已知 OD 值的固态滤光片进行校验；
通常用于紫外区（260 nm、280 nm）检测；
可配合比色皿架适配酶标仪进行波长响应测定。
三、荧光检测校准用标准品与校准板
3.1 荧光校准的重要性
检测激发光源（LED 或氙灯）强度是否足够；
判断探测器（PMT）灵敏度有无下降；
校验滤光片通带中心位置是否偏移；
评估不同孔位荧光强度的均一性；
检查内滤效应及信号漂移趋势。
3.2 常用荧光校准材料
（1）荧光标准板（Fluorescence Validation Plate）
材质为黑色聚苯乙烯板，孔内涂覆标准荧光物质，如 Europium、Fluorescein、Rhodamine 等；
每孔具有不同荧光强度；
有效激发波长常见为 485 nm / 发射 528 nm；
多用于校验灵敏度、动态范围和重复性。
（2）荧光染料标准液
荧光素钠（Fluorescein Sodium Salt）：典型绿色荧光，激发 485 nm / 发射 530 nm；
罗丹明 B（Rhodamine B）：红色荧光，激发 540 nm / 发射 625 nm；
欧罗品螯合物（Europium Chelate）：长寿命荧光，用于时间分辨荧光。
操作建议：使用标准液时应注意避免光照降解、pH变化或温度波动导致信号漂移。
（3）固态荧光标准棒或校准器
如 Starna 或 Avantes 提供的固定发光棒；
利用标准激发源打光并测量其反射荧光；
适用于场外校准或仪器生产商原厂检测。
四、化学发光校准所需材料
4.1 发光系统稳定性需求
化学发光依赖化学反应释放光子，不同于荧光或吸光度具有明确的“静态标准”。因此，校准的重点在于：
验证 PMT 检测器灵敏度；
检查背景发光与暗电流；
校验发光衰减曲线响应。
4.2 校准材料推荐
（1）Luminometer Reference Plate
固态或液态标准板，含有标准发光材料；
可重复发光，或采用一次性标准剂量设置；
适用于 Chemiluminescence 检测稳定性验证。
（2）标准化发光液体试剂盒
如 HRP-催化 Luminol 体系的校准液；
Thermo、PerkinElmer 提供专用的高稳定性发光试剂包；
可用于拟合发光动力学曲线与最大峰值强度。
注意事项：需在黑暗中操作，避免环境光干扰；发光试剂要现配现用，防止预反应或衰减。
五、其他关键校准板类型与用途
5.1 空白校准板（Blank Plate）
无液体、无反射材料的透明孔板；
用于测定仪器暗电流、背景噪声；
也可用于检测孔间光串扰；
在校准程序中用于“零点校准”。
5.2 板位校准板（Well Alignment Plate）
有固定反射点或标识的校准板；
检测机械臂、读头对每个孔位置的精确定位；
常用于光路扫瞄仪自动对焦与定位矫正。
5.3 路径长校准板（Pathlength Calibration Plate）
用于确定酶标仪在不同体积下等效光程补偿系数；
通常需配合含已知 OD 值的标准液使用；
支持路径校正功能的酶标仪，如 SpectraMax 需搭配使用。
六、标准品使用方法与注意事项
6.1 标准板的使用步骤简述：
清洁仪器与校准板表面；
打开酶标仪软件，进入“校准模式”或“验证向导”；
将校准板放入托盘，注意方向标识一致；
按照仪器提示选择对应标准板类型与检测模式；
执行自动读取，记录各孔吸光度/荧光值/发光强度；
与出厂标注值比对，判断是否在容差范围内；
保存校准日志，作为性能记录文件归档。
6.2 使用注意事项
温度控制：标准品需在室温恒定（20–25°C）下使用；
光照保护：荧光标准液避免暴露强光；
避免交叉污染：液体标准液操作需使用一次性吸头；
校准周期：一般建议每季度或每月进行一次全功能校准；
不可用于样品测定：校准标准品为稳定性材料，不能用于实验定量。
七、常见标准板品牌与供应商
| 品牌/制造商 | 产品名称 | 适用校准类型 | 特点 |
|---|---|---|---|
| Thermo Fisher | SkanIt Validation Plate | 吸光度、荧光 | 与 Multiskan 系列兼容 |
| BioTek (Agilent) | Test Plate | 吸光度、光路校准 | 可用于 Gen5 系列仪器 |
| Molecular Devices | PathCheck Calibration Tools | 吸光度、路径补偿 | 专用于 SpectraMax |
| Starna | Solid State Fluorescence Standard | 荧光校准 | 高重复性固态荧光标准 |
| Calibrant | Luminometer Calibration Plate | 化学发光 | 可多次使用、耐光性好 |
| NIST | SRM 930d | 吸光度溯源 | 国际标准吸光度物质 |
八、校准与验证的关系及常见误区
8.1 校准与性能验证的区别
校准（Calibration）：使用标准物对仪器读数进行调整，改变仪器内部参数；
验证（Verification）：对比仪器读数与标准值，仅作性能评价，不做调整。
实验室日常使用中，建议将两者结合进行。例如每月执行一次完整校准，每周进行一次性能验证。
8.2 常见误区
误以为软件校正等同校准：软件的“自动归一化”功能仅对数据做数学处理，并非真正意义上的校准；
长期不校准：一些实验室因使用频率低而忽视校准，但即便低频使用，也可能因环境温湿度变化导致光学系统变化；
只校准一种检测模式：使用多模式酶标仪时，需分别对吸光度、荧光、发光分别校准。
九、结语：校准是保障酶标仪准确性的关键环节
校准不仅是仪器使用规范的体现，更是保障实验数据可靠性、可重复性和对外可比性的核心步骤。针对酶标仪，吸光度、荧光、化学发光三大主流检测模式需配备各自合适的校准标准品和校准板，结合科学的操作流程和维护机制，方能实现仪器始终处于最佳性能状态。
随着数字化实验室和智能仪器的发展，未来酶标仪的校准将可能实现全自动化、可追溯化和标准化——如通过二维码识别标准板批次、自动记录校准历史、集成校准提醒功能等。研究人员与管理人员在使用酶标仪过程中，应积极建立并执行完善的校准制度，确保实验结果在“看得见”的光学精度基础上始终可靠、真实与科学。
