酶标仪化学发光检测原理是什么？
一、化学发光的基本概念
化学发光（Chemiluminescence，CL）是化学反应直接放出光子的现象。与荧光不同，化学发光无需外部光源激发；发光体系自身的化学反应就能将反应能量转换为光能。由于省去了激发光，背景散射和自发荧光大幅降低，信噪比更高，非常适合超低丰度分析。
二、发光底物与酶学反应
酶标仪常见的化学发光底物分为两大类：
过氧化物酶体系
辣根过氧化物酶（HRP）/鲁米诺体系：HRP催化H₂O₂氧化鲁米诺，生成3-氨基邻苯二甲酰肼自由基和过氧化物中间体。它们在退激过程中释放 425 nm 左右的蓝光；加入增敏剂（对-羟基苯乙酸、4-IPBA 等）可延长发光时间并提高量子产率。
过氧化氢酶（POD）/醛类体系：尽管少见，但在高通量环境中可以与萤光素衍生物结合形成更长波段发光。
萤光素酶体系
荧光素酶-ATP-萤光素体系：萤光素酶将萤光素、ATP 与 O₂ 作用，生成氧化萤光素。其失活时产生约 560 nm 的黄绿光。此体系强调 ATP 参与，因此常用于能量代谢及细胞活力测试。
肛门发光素酶（Gaussia, NanoLuc 等）体系：新型小分子酶，发光强度更高，衰减曲线平缓，特别适合连续监测。
三、信号产生与放大机制
化学发光的光子产额通常随底物氧化还原电位、酶活力与增强剂三方面共同决定。微孔板中底物浓度被设计成过量，保证酶学反应为零级动力学；单个靶标结合位点就能触发多次循环催化，从而放大信号。除多周转放大外，还可通过 闪光（flash） 与 辉光（glow） 两种采集策略进一步提高可检测窗口：
闪光模式：瞬时注入底物后光信号迅速达到峰值并快速衰减，适合读数速度极快的仪器。
辉光模式：使用缓释剂或增敏剂让反应缓慢进行并维持数分钟至数小时，便于多点模式采集。
四、光学检测模块
化学发光酶标仪的核心探测器为光电倍增管（PMT）或背照式 CMOS。PMT 具备 10⁶ 以上的电子倍增倍率，可捕捉单光子事件；CMOS 虽然灵敏度略低，但具备二维成像能力，可实现孔间直接成像。光路通常取消激发滤光片，保留 发射滤光片或单色器 以抑制环境杂散光。光路还包含可调节的 Z 轴焦面定位 机构，确保不同深度的孔底发光能正确聚焦到探测器。
五、系统灵敏度与动态范围
化学发光检测的理论检出限可低至数亚摩尔水平。仪器标称灵敏度由最高倍增增益、积分时间与暗电流决定。动态范围常在 6–7 个数量级；当信号过强，仪器通过缩短积分时间或降低增益避免饱和。相对荧光法，化学发光在高亮度区域不易受到内滤效应限制，因此线性范围更宽。
六、时间分辨与瞬时采集
某些快速闪光反应的半衰期仅 0.3–2 s，要求酶标仪具备毫秒级注液与同步读数功能。典型做法是在检测臂顶部集成 注射泵，底物注入同时触发探测器开始积分。对药效动力学实验，研究者会设置多次短积分循环，实时记录发光衰减曲线，并用指数衰减方程拟合酶活或结合速率。
七、影响定量准确性的因素
底物纯度与批次差异：氧化副产物会自发发光，抬高背景。
温度波动：多数化学发光体系对温度敏感，每升高 1 °C，发光强度可能升高 5–15 %。仪器采用金属块或热电模块恒温。
孔间溅液与封板时间：闪光模式若注液不均，峰值信号差异明显。
光漂白与衰减：虽无激发光漂白，底物仍会在采集过程中逐渐耗尽，需要标准曲线内插。
光学串扰：高平底微孔板壁薄，侧向散射可使强信号孔影响邻孔。黑色壁、透明底板能显著减少串扰。
八、仪器校准与质量控制
化学发光酶标仪的增益、暗噪声与线性应每月校准一次。方法包括：
使用 NIST 溯源发光标尺 测定绝对量子效率；
定点稀释萤光素钠盐/鲁米诺体系，绘制理论线性曲线；
比较重复测量的相对标准偏差（RSD），保证 < 5 %。
此外，还需对自动注液系统做死体积与注射精度验证，以防系统漂移导致峰值偏移。
九、与其他光学检测技术的比较
| 指标 | 化学发光 | 荧光 | 吸光度 |
|---|---|---|---|
| 激发光源 | 无 | 有 | 无 |
| 信噪比 | 极高 | 中 | 低 |
| 动态范围 | 6–7 级 | 4–5 级 | 2–3 级 |
| 光漂白 | 无 | 有 | 无 |
| 适用极低丰度 | 极佳 | 较佳 | 较差 |
化学发光在追求极限灵敏度时优于荧光，但若要实时观察细胞形态或多色复合读数，荧光仍更灵活。
十、应用场景与未来趋势
免疫检测试剂盒：CLIA（化学发光免疫分析）已成为甲状腺激素、肿瘤标志物检测金标准。
基因扩增终点检测：qPCR 末端使用 dNTP-发光体系代替染料，可免除抑制剂影响。
细胞信号转导研究：NanoLuc-报告基因配合实时读取，实现秒级动态监测。
药物高通量筛选：辉光体系稳定，可在自动化流水线中长时监控数千化合物。
未来趋势包括 多酶串联放大、光纤耦合微流控芯片、AI-增强低光子计数算法。随着探测器暗噪声进一步降低，单细胞水平的化学发光读数有望进入常规实验室。
总结
酶标仪化学发光检测本质上是通过特定酶促反应将化学能快速高效地转化为光能，再利用高灵敏度光电倍增管或 CMOS 器件实现定量。其不需激发光源，背景极低，结合多周转催化放大，能够提供纳摩尔到阿托摩尔级别的检测极限和宽广动态范围。掌握底物化学、光路设计与时间分辨采集等关键参数，可将该技术优势最大化，满足现代分子诊断、高通量药筛及生命科学研究对灵敏度和通量的双重需求。
