酶标仪常见的检测模式有哪些？
一、仪器定位与检测模式概念
酶标仪（microplate reader）本质上是一台可对标准微孔板进行光学扫描与数据处理的多功能分析平台。它通过不同的光学模块、滤光片或光栅以及探测器组合，完成对样品吸收光、发射光或散射信号的捕捉与量化。所谓“检测模式”，指仪器在一次测定中所选择的物理测量方式、光源类型、光路布局与信号读取算法的综合配置。模式差异直接决定可检测的分子类型、灵敏度上限、背景噪声以及适用的生化或细胞学实验范围。
二、经典吸收光模式（Absorbance）
端点吸收（Endpoint）
最早也是最基础的 ELISA 读数方式。仪器对反应终止后的微孔板在固定波长下快速扫描，输出光密度（OD）。适用于终点显色检测，如酸终止 TMB 法、碱终止 PNPP 法等。多波长差分比值（Dual／Multi-λ）
通过主峰与参比峰差值计算降低比色皿、微孔壁或指纹污渍带来的背景漂移，常用于低 OD 区间的高精度定量，例如低丰度激素检测试剂盒。动力学吸收（Kinetic）
在恒温状态下对同一孔进行多次连续监测，记录反应速率曲线，可计算米氏常数、抑制常数、Vmax 等酶动力学参数，亦可用于细胞增殖曲线分析（实时 CCK-8）。光谱扫描（Spectral Scan）
以2–5 nm 步长扫描200–999 nm 全谱或选定范围，输出吸收光谱图。可用于纯化蛋白、核酸的峰位确认和杂质分析，也能辅助开发新型显色底物。
三、荧光强度模式（Fluorescence Intensity, FI）
顶读（Top Reading）与底读（Bottom Reading）
顶读适合无色或透明基质中的溶液反应；底读利用透明或黑色微孔板底窗口，减少上层液面反射，对 adherent 细胞钙流、pH 探针信号尤为友好。单波长发射／扫描发射
常规 FITC、Cy5 等标准荧光团检测多采用固定激发与发射滤光片组合；宽带发射扫描可在未知荧光团筛选、FRET 谱图测绘中使用。动力学荧光
与动力学吸收类似，可实时记录离子浓度变化（Fluo-4 钙流）、ROS 生成速率等动态过程。内置温控与振荡
现代模块允许37 °C 恒温与轨道震荡，配合报时拍频算法，可进行活体细胞多天实时监测，如 GFP-reporter 基因表达曲线。
四、时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence, TRF）
TRF 通过脉冲激光或氙闪灯激发 Eu³⁺、Tb³⁺ 等长寿命配位物，延迟微秒级再采样，有效避开背景自发荧光。此模式广泛服务于DELFIA、LANCE Ultra 体系，提供比常规 FI 高数十倍的信噪比，是微量激素、细胞因子与低拷贝核酸检测的利器。
五、时间分辨 FRET（TR-FRET）
在 TRF 的延迟采样基础上引入供体-受体能量共振转移。典型配对为 Eu-Cryptate/Tb-Chelate 供体与 XL665 或 d2 受体（见 HTRF、LANCE TR-FRET 套件）。距离敏感特性使其能在无需洗板的匀相体系中定量蛋白-蛋白、蛋白-小分子相互作用，常用于激酶筛选与 GPCR 结合亲和力测定。
六、荧光偏振（Fluorescence Polarization, FP）
FP 利用小分子结合大分子时旋转相关时间延长导致偏振度升高的原理，以平行与垂直分量发射比值表示结合程度。重要于药物发现中的受体配体竞争、DNA 结合蛋白筛选，且检测为匀相、无需分离步骤，兼具速度与高通量。
七、化学发光（Luminescence）
辉光型（Glow）
稳定光强持续数分钟至数小时，如 Promega Bright-Glo 体系，用于报告基因双荧光素酶测定。无需同步注射，适合批量终点读取。闪光型（Flash）
反应瞬间达到高峰后迅速衰减，典型如 ATP 检测的 luciferin-luciferase。需要注射器模块实时加底物并立即采样。BRET/BRET2
利用 NanoLuc、Renilla 等酶作为供体自发发光源，与 YFP、mNeonGreen 等受体形成类似 FRET 的无标激发能量转移。可在活细胞中原位跟踪 GPCR-β-arrestin 招募、蛋白二聚化。NanoBRET/NanoGlo HiBiT
NanoLuc 小标签与 HiBiT 重组体系推动了超灵敏蛋白定量与实时内吞/分泌监测，为 CRISPR 贴标细胞提供低背景、高动态范围解决方案。
八、近红外激光激发散射（AlphaScreen / AlphaLISA）
该技术采用 680 nm 激光激发供体珠产生单线态氧，将能量传递到距离 < 200 nm 的受体珠后于 520–620 nm 发光。AlphaLISA 相较传统 AlphaScreen 更稳定、信号更集中。优点在于：
无需洗涤，可在血清、培养基等复杂基质中定量蛋白。
动态范围 4–5 log，适合高通量药筛。
缺点为耗材价格高，对光、温度敏感。
九、多模模式与组合检测
现代多模酶标仪整合多光路，允许一次实验同时读取两种以上信号，典型应用包括：
FI + Absorbance：同孔检测 NADH 转化吸收下降与荧光探针生成。
Dual-Luciferase：Firefly 与 Renilla 两通道顺序注入。
Luminescence + FI：NanoLuc 伴随 GFP 内参校正细胞数。
十、特殊扩展模式
| 模式 | 关键特点 | 应用示例 |
|---|---|---|
| Nephelometry/Turbidity | 测散射光强衡量颗粒浓度 | 免疫沉淀、蛋白聚集 |
| OD600 细菌生长曲线 | 600 nm 底读，自动振荡 | 抗生素敏感性、代谢工程 |
| 微平板青年格差热转移（Differential Scanning Fluorimetry, DSF） | 温度梯度 + SYPRO Orange 荧光 | 蛋白稳定性筛选、小分子结合热迁移 |
| Label-Free 酿酒石英微天平衍射（Corning Epic） | 波导光束位移检测 | GPCR 早期信号、细胞形变 |
十一、影响检测模式选择的关键因素
信号强度与背景噪声
低拷贝目标用 TRF、化学发光；强信号快速筛选可用常规 FI。样品基质
高色度、高荧光自发背景样品建议选 TR-FRET 或 AlphaLISA。通量与成本
荧光偏振、FI 匀相法耗时少，费用低；Alpha 系列耗材昂贵但简化流程。仪器硬件
需确认是否配备注射器、时间分辨模块、激光器、偏振片等。软件算法
动力学模式需具备 Michaelis-Menten 拟合、IC₅₀/EC₅₀ 自动运算功能。
十二、未来趋势
全光谱瞬时采集：基于 CMOS 排列光栅的阵列探测器，可在毫秒级完成全孔全谱读数，加速深度学习定量分析。
微型化与现场检测：掌上型 Wi-Fi 芯片读板器结合试剂预封装芯片，实现 POC 肿瘤标志物检测。
多维信号融合：将电阻抗、光声、机械响应与传统光学信号并行采集，提高对多组分体系的解析度。
AI 驱动算法：基于光谱-时间-空间三维数据的智能去卷积，减少交叉干扰，提高复杂药筛阳性检出率。
结语
酶标仪检测模式的多样化，使其从最初的 ELISA 专用设备演进为覆盖酶学、分子互作、信号通路解码、活体成像乃至无标签生物物理学的综合平台。恰当选择检测模式、优化板型与微环境条件，是获得可靠数据的关键。随着硬件微型化、光学器件升级及 AI 数据算法的快速迭代，未来酶标仪将承担更广阔的跨学科角色，为生命科学与精准医疗提供更高通量、更高灵敏度、更低成本的解决方案。
