一、取样前的准备

1. 环境及实验室准备

• 确认实验室常规无菌操作区（生物安全柜或洁净操作台）空气质量符合 1000 级或更高标准。

• 保证实验室内无明火、强烈气流以及其他会影响无菌操作的因素。

• 对照培养箱运行状态，记录当前温度（37°C）、CO₂ 浓度（5%）和湿度。以便后续评估取样对参数波动的影响。

1. 人员防护与器材准备

• 穿戴完整的实验服、闭合式实验鞋，并在无菌操作区更换一次性无粉手套，手套外部及腕部应喷洒 70% 酒精进行擦拭消毒。

• 准备取样所需的无菌耗材：吸头、移液管、离心管（预标号）、试管架、培养皿等，并在生物安全柜内进行紫外灯 15 分钟灭菌。

• 如需使用株取样工具（如刮刀、镊子），应在高压灭菌器中预先灭菌，并在使用前置于生物安全柜中自然冷却。

1. 培养箱表面及内腔预消毒

• 用实验级酒精棉巾或无纤维棉片蘸取 70% 酒精，依次擦拭培养箱门把手、门封条及外部面板，确保表面无肉眼可见污物。

• 打开培养箱门前，再次对门缝及观察窗进行局部喷雾式酒精处理，静置 1 分钟后再进行操作，避免酒精挥发带入过多气流扰动。

二、取样操作流程

1. 最小化开门时间

• 事先熟悉培养箱内样本位置，将要取样的培养皿或培养瓶按编号预先排列在便于触及的托盘上。

• 操作时集中精力，避免开门后因手忙脚乱导致开门时间过长；理想情况下，整个取样步骤（打开—取样—关闭）不应超过 20–30 秒。

1. 取样步骤

• 打开门扳手：缓慢拉开箱门至停靠位置，不要一次性拉到底，以免突然气流扰动箱内环境，改变温湿度及 CO₂ 分布。

• 手臂进入：将双手依次伸入培养箱内，保持肘部靠近箱门缝，减少箱内温度与环境空气的直接置换。

• 取出样品：用一只手握住培养皿底部，用另一只手稳住移液管或吸头，取出所需培养基或细胞悬液。过程轻柔，避免震动所移培养瓶。

• 样品转移：将取出的样本放置于预先准备好的试管架或离心管架上，迅速移出箱外，务必在 10 秒内完成转移。

1. 样品关闭与编号

• 取样完成后，立即给离心管或试管盖紧，并用防水记号笔在外侧标注样品编号、时间及处理人姓名。

• 若后续仍需在培养箱内继续取样，可将下一个样本的编号提前写好，放置在取样耗材区，减少箱内操作时的手部动作。

三、取样后培养箱恢复

1. 关门及回温

• 轻轻推动箱门，确保门封条完全贴合，不留缝隙。

• 等待至少 5 分钟（若箱内外温差较大建议 10 分钟），以便培养箱参数恢复到取样前状态。监测并记录环境参数波动情况，若超出±0.3°C 或 CO₂ 浓度超出±0.2%，需作为异常记录处理。

1. 监测与记录

• 观察培养箱面板显示或联网监控系统读取的实时数据，确保温度、湿度及 CO₂ 浓度恢复至预定值。

• 填写培养箱日志，记录本次取样操作人、时间、持续开门时间及参数波动幅度，便于后续分析和质量追踪。

四、安全与无菌注意事项

1. 严格无菌操作

• 整个取样过程中，禁止将非无菌物品（如笔、手机、实验记录簿）带入培养箱。

• 对接触到培养箱内腔或培养基外部的手套，应视为“已污染”，不可再次用于下一次取样，需更换后重复酒精消毒。

1. 使用无菌耗材

• 一次性耗材如移液吸头，务必使用带滤芯的无菌吸头，以避免细菌、真菌或尘埃随气流进入培养箱。

• 离心管、移液管等瓶盖、刻度管接触过空气的内表面，需在生物安全柜内进行酒精灭菌或紫外灯照射至少 5 分钟。

1. 防止交叉污染

• 对多株细胞或多种菌株取样时，每个样本使用单独的移液器或消毒后的工具，并在每次操作前后进行更换或消毒。

• 若取样过程出现意外（如手套撕裂、耗材污染等），应立即停止操作，更换手套及耗材，并对操作区进行二次灭菌处理。

1. 人员培训与制度

• 操作人员须经过系统的无菌技术培训，并通过考核后方可独立进行培养箱取样。

• 实验室应制订并张贴《CO₂ 培养箱操作与取样规范》，明确步骤、时长和应急处理流程。

五、应急处理与善后清理

1. 突发故障

• 如在取样过程中培养箱突然报警或断电，应立即关闭箱门，启动实验室应急电源或更换备用培养箱。

• 对已取出的样本，立即放入二级生物安全柜中继续后续操作，避免样本因温度骤降而死亡或污染。

1. 善后消毒

• 每次取样完成后，用 70% 酒精或 0.5% 次氯酸钠溶液擦拭门把手及门封条；

• 每周对培养箱内腔进行一次全面擦拭，可配合 0.5% 次氯酸钠，作用 10 分钟后再用蒸馏水擦净，最后用 70% 酒精收尾，保证箱内环境长期无菌。

六、优化与持续改进

1. 减少开门频率

• 如果实验室有多个取样需求，建议集中批量取样，减少对培养箱的多次开门干扰。

• 可考虑使用内置取样口或手套箱附件，必要时向厂商定制带有无菌隔膜的取样管路接口。

1. 自动化监控

• 结合培养箱的数据导出功能，将温度、湿度及 CO₂ 参数导入 LIMS 系统，自动生成波动报告，及时发现异常波动并反馈。

• 对常用培养条件和取样时长的数据进行统计分析，优化操作 SOP，缩短取样所需时间。

1. 培训与评估

• 定期组织培养箱操作培训，邀请资深技术人员示范并指导新员工，逐步形成成熟的技能传承机制。

• 实验室管理者应不定期抽检操作记录和样本质量，评估取样流程的执行效果，不断完善培训内容。