赛默飞实时荧光定量PCR实验步骤主要包括实验前准备、PCR扩增反应的设置、实时荧光检测、数据分析和结果解读。这些步骤适用于大多数赛默飞的QuantStudio系列qPCR仪器，如QuantStudio™ 5、QuantStudio™ 6 Flex等。以下是具体操作流程：

一、实验准备阶段

1. 实验材料准备

• 试剂：选择合适的qPCR试剂，如SYBR Green试剂或TaqMan探针试剂。使用预制的qPCR Master Mix可以简化反应设置。

• 引物设计与合成：设计靶基因的特异性引物。引物应该有适当的Tm值（通常为60°C左右），并经过验证无二级结构。

• 模板制备：提取高质量的DNA或RNA（cDNA）模板。确保模板无降解和污染，RNA需要逆转录为cDNA后进行定量PCR。

• 耗材：准备qPCR反应板（96孔或384孔）、封板膜、移液器和移液枪头。

2. 仪器准备

• 启动qPCR仪器（如QuantStudio™ 5），确保设备处于正常工作状态。

• 打开qPCR分析软件，选择实验模板或新建实验项目，输入实验参数。

二、反应体系设置

1. 反应体系配置

每个反应体系通常为 10-20 µL，具体组分为：

• qPCR Master Mix：2x浓度，包含Taq酶、dNTPs、缓冲液等（一般为5-10 µL）。

• 正向引物和反向引物：每个引物的最终浓度为 0.2-0.4 µM（通常为0.4 µL）。

• 探针（如使用TaqMan探针）：根据实验设计添加适当浓度的荧光探针。

• 模板DNA或cDNA：根据模板浓度，每个反应体系中加入1-10 ng模板。

• 无核酸酶水：补足总反应体积至10-20 µL。

2. 样品与标准品的设置

• 样品：将各个待测样品的反应体系按上述比例配制，并加至qPCR反应板的各个孔中。

• 标准品：如果进行绝对定量实验，需准备不同浓度梯度的标准品，并根据浓度分配至qPCR反应板的各个孔。

• 阴性对照（NTC）：无模板对照，用于检测污染。

3. 加样与封板

• 使用移液器准确加入各反应组分，避免交叉污染。

• 加样完成后，使用封板膜封住qPCR板，确保样品在反应过程中无蒸发。

三、PCR反应设置与启动

1. 实验参数设置

在赛默飞qPCR仪器（如QuantStudio™ 5）上，打开软件，设置PCR反应参数：

• 反应体积：10 µL或20 µL，取决于实验反应体系体积。

• 热循环程序：

• 初始变性：95°C，30秒至2分钟，用于激活Taq酶并变性DNA模板。

• 循环步骤：

• 循环次数：通常为40-45个循环。

1. 变性：95°C，10-15秒。

2. 退火和延伸：60°C，30-60秒（此时进行荧光信号采集）。

• 熔解曲线（仅限SYBR Green法）：如使用SYBR Green染料，需设置熔解曲线分析，通常为 60°C 至 95°C 的升温过程，用于区分特异性产物和非特异性产物。

2. 启动反应

• 确认所有实验参数设置正确后，点击**“启动”**按钮，开始qPCR反应。系统将实时监测每个循环中的荧光信号。

四、实时荧光检测

在扩增过程中，赛默飞qPCR仪会实时采集每个PCR循环中产生的荧光信号，并将其记录到计算机中。荧光信号的强度反映了扩增产物的量，系统会根据这些数据生成荧光扩增曲线。

五、数据分析

1. Ct值确定

• Ct值（循环阈值）是指荧光信号达到指定阈值时的PCR循环数。Ct值越低，表示起始模板量越高。软件会自动计算每个样品的Ct值。

2. 相对定量分析（2^-ΔΔCt法）

• 当进行相对定量分析时，通常使用内参基因（如GAPDH、ACTB）来标准化数据。相对定量方法常用 ΔΔCt 计算样品相对表达量。

3. 绝对定量分析

• 如果使用标准曲线进行绝对定量，软件会根据标准品的Ct值绘制标准曲线，并通过标准曲线计算样品的绝对浓度。

4. 熔解曲线分析（仅限SYBR Green法）

• 使用SYBR Green染料时，熔解曲线分析有助于确定PCR扩增产物的特异性。单一的熔解峰表明扩增产物特异性良好，多个熔解峰可能提示非特异性产物。

六、结果解读与保存

1. 扩增曲线和标准曲线：查看扩增曲线是否平滑上升，确认样品Ct值是否合理；检查标准曲线的线性关系。

2. 报告生成：软件会生成实验报告，包括Ct值、熔解曲线图和标准曲线（如果适用）。

3. 数据保存与导出：用户可以导出实验数据，保存为PDF或Excel文件格式，便于后续分析和结果报告。

七、注意事项

1. 样品与试剂：确保所有试剂新鲜并适当储存，样品无降解或污染。

2. 操作步骤：每一步操作都要精确，避免交叉污染和操作误差，确保实验结果可靠。

3. 实验控件：设置适当的对照组，如阳性对照、阴性对照和无模板对照，保证结果的可靠性。

八、总结

赛默飞实时荧光定量PCR仪器操作步骤涵盖了从实验准备、PCR反应设置、实时监测到数据分析的全过程。赛默飞QuantStudio系列qPCR系统凭借其高精度、易操作和强大的数据分析功能，广泛应用于基因表达定量、病原体检测和突变分析等领域。