1. 参考基因在qPCR中的作用

在qPCR实验中，实验的目标是定量分析某个或某些目标基因的表达水平。然而，不同样本间的RNA提取效率、反转录效率以及PCR扩增效率可能存在差异。因此，实验结果的准确性往往受到这些因素的影响。为了排除这些技术性变异对结果的干扰，研究人员通常会选择一个或多个内参基因，通过标准化处理来校正这些潜在的实验误差。

参考基因的选择在很大程度上决定了qPCR结果的可信度。理想的参考基因应该是稳定表达的，不受实验条件、处理方法或组织类型的影响。通过比较目标基因与参考基因的表达比例，研究人员能够获得目标基因的准确表达量。

内参基因的标准化作用

• 校正样品间差异：样本处理过程中的不一致性（如RNA提取量的差异）可能会导致qPCR结果的偏差。参考基因的使用可以消除这些偏差，使得各个样本间的表达水平具有可比性。

• 消除反转录效率的影响：不同样本中的mRNA转录效率可能会有所不同，导致最终结果的变异。通过标准化参考基因的表达，能够有效消除这类影响，提高数据的准确性。

• 校正PCR扩增效率的变化：PCR扩增过程中，不同样本间的扩增效率可能不同。参考基因通过提供稳定的扩增信息，帮助校正扩增过程中的变化，确保qPCR结果的可重复性和可靠性。

2. 如何选择合适的参考基因

选择合适的参考基因是确保qPCR实验结果准确性的关键。一个理想的参考基因应该在所研究的所有样本和实验条件下保持稳定表达，并且不受处理条件或生物学因素的影响。以下是选择参考基因时需要考虑的几个关键因素：

1. 基因的稳定性

最重要的选择标准是参考基因的稳定性。理想的参考基因应该在不同的实验条件、组织类型、处理方法和时间点下保持相对稳定的表达水平。如果参考基因的表达在实验组和对照组之间出现波动，可能导致标准化结果的不准确。因此，选择具有稳定表达的基因是非常重要的。

常见的参考基因包括GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、ACTB（β-肌动蛋白）、18S rRNA（18S核糖体RNA）等。尽管这些基因在很多实验中被广泛使用，但不同的实验条件和样本类型可能会影响它们的稳定性。因此，选择之前，最好通过实验验证这些基因在特定实验条件下的稳定性。

2. 不同组织和处理条件下的适用性

不同的组织、细胞类型或处理条件可能导致参考基因的表达发生变化。例如，某些参考基因可能在癌症组织中表达稳定，但在正常组织中表现不稳定，或在药物处理下发生变化。因此，在进行qPCR实验时，研究人员应该根据实验对象的类型和处理条件选择合适的参考基因。

例如，在对不同组织类型进行qPCR分析时，可能需要使用不同的参考基因。某些基因（如ACTB）在某些组织类型中可能表现出较强的表达稳定性，而其他基因（如GAPDH）则可能会受到组织特异性因素的影响。

3. 使用多个参考基因的策略

有时，单一参考基因可能无法满足所有实验条件下的稳定性要求。因此，在实际应用中，研究人员常常会选择两个或多个参考基因进行标准化。这种多基因的标准化方法通常能够提高数据的可靠性，减少单一参考基因选择带来的误差。

一些研究表明，使用多个参考基因（如GAPDH、ACTB、HPRT）可以显著提高基因表达分析的准确性，尤其是在样本来源和实验处理差异较大的情况下。选择多个参考基因可以通过计算这些基因表达量的几何平均值来获得更稳定的标准化数据。

4. 避免选择处理响应型基因

在选择参考基因时，研究人员应避免选择那些可能在实验处理过程中受到显著影响的基因。例如，在研究炎症反应或药物治疗对基因表达的影响时，GAPDH和β-肌动蛋白等常见的参考基因可能在某些情况下会受到处理的影响，导致其表达量发生变化。选择这些基因作为参考基因可能会影响实验的准确性和可比性。

3. 评估参考基因的稳定性

选择参考基因后，下一步是评估其在不同实验条件下的稳定性。通常，稳定性较高的参考基因在不同的样本中表现出相似的表达水平，而稳定性较低的基因在不同样本中的表达会有明显波动。评估参考基因的稳定性常用的方法包括：

1. 使用统计分析工具

一些统计工具和软件可以帮助研究人员评估参考基因的稳定性。例如，geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件可以根据样本数据的变异性计算参考基因的稳定性分数，帮助用户选择最合适的参考基因。

• geNorm：通过计算每对基因之间的相关性，geNorm能够为每个参考基因分配一个稳定性指数。该软件提供了一个可以评估多个参考基因稳定性的标准。

• NormFinder：NormFinder采用方差分析方法，能够识别在不同处理条件下最稳定的参考基因。它提供了更精确的稳定性排序，尤其适用于涉及复杂实验设计的情况。

• BestKeeper：BestKeeper根据参考基因表达的标准差计算其稳定性，能够有效评估在不同实验条件下参考基因的表现。

2. 实验验证

尽管统计工具能够提供初步的参考基因选择建议，但最终选择参考基因的标准应通过实验验证。在实验中，研究人员可以测量多个参考基因在不同样本中的表达水平，并与目标基因的表达进行比较。通过这种方式，研究人员可以更好地理解参考基因在实际实验中的表现，从而做出最终选择。

3. 阈值选择与标准化

选择合适的参考基因后，研究人员需要使用阈值循环数（Ct值）来计算目标基因与参考基因之间的相对表达水平。Ct值越低，表示基因表达越高。通过计算目标基因和参考基因的Ct值差异，可以得到目标基因的相对表达水平。使用多个参考基因时，可以使用几何平均法来计算多基因的标准化值。

4. 常用的参考基因及其特点

1. GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）

GAPDH是最常用的参考基因之一，广泛应用于基因表达分析。然而，尽管它通常具有稳定的表达，但在某些情况下（如肿瘤细胞、炎症反应等），GAPDH的表达可能会发生变化，因此需要进行验证。

2. ACTB（β-肌动蛋白）

ACTB是另一种常用的参考基因，尤其在涉及细胞骨架和细胞功能的研究中。其表达通常在多数组织中较为稳定，但在某些生物学过程中（如细胞增殖和迁移），其表达可能会发生变化。

3. 18S rRNA（18S核糖体RNA）

18S rRNA通常用于高RNA量的样本中，因其在细胞内的表达较为稳定。然而，它的稳定性可能受到处理条件和组织类型的影响，需根据实验条件验证其适用性。

4. HPRT（次黄嘌呤核糖核酸）

HPRT是一种广泛应用的参考基因，尤其在涉及代谢和核苷酸合成的研究中。其表达较为稳定，但在某些条件下仍然需要验证其稳定性。

5. 总结

参考基因的选择是qPCR实验成功的关键因素之一。选择合适的参考基因不仅能提高数据的可靠性，还能为目标基因的定量分析提供准确的基准。赛默飞Q3荧光定量PCR仪支持多种参考基因的选择和评估，用户可以根据实验条件、样本类型及研究目的选择最合适的参考基因。通过结合统计工具和实验验证，研究人员能够确保qPCR实验数据的准确性，从而推动基因功能研究、疾病诊断、药物开发等领域的进展。