赛默飞荧光定量PCR仪 q3 扩增程序设置

一、引言

荧光定量 PCR（qPCR）是分子生物学中广泛应用的核酸定量检测技术，其结果精确性不仅取决于试剂与样本质量，还高度依赖于扩增程序的合理设定。赛默飞荧光定量PCR仪 q3 作为一款性能稳定、操作直观的设备，支持多种检测化学体系，如 SYBR Green、TaqMan 探针等。合理的扩增程序设置可确保反应的高扩增效率、良好重复性和准确的定量分析结果。

二、扩增程序的基本原理

1. qPCR 扩增过程概述

扩增程序由若干循环步骤组成，每一步温度和时间的设定直接决定了反应的特异性和效率。标准 qPCR 包含以下几个核心阶段：

1. 初始变性（Initial Denaturation）

• 高温下彻底分离双链 DNA，激活热启动 DNA 聚合酶。

2. 循环变性（Denaturation）

• 每一循环的高温阶段，用于分离模板链。

3. 退火（Annealing）

• 引物与模板结合，温度取决于引物 Tm 值。

4. 延伸（Extension/Elongation）

• DNA 聚合酶沿着模板合成新链，同时检测荧光信号（实时监测）。

5. 熔解曲线（Melt Curve）分析

• 逐步升温，分析产物特异性。

三、赛默飞 q3 仪器扩增程序界面特点

1. 界面结构

• 程序编辑区：以步骤为单位显示温度与时间参数，可添加、删除或调整顺序。

• 循环设置区：定义每组步骤的重复次数。

• 荧光采集设置：可选择在特定温度点采集数据，支持多通道独立设定。

2. 常用功能

• 温度梯度：用于退火温度优化实验。

• 多重 PCR 设置：支持不同通道在不同步骤采集信号。

• 快速程序与标准程序切换：根据酶性能和实验需求选择。

3. 保存与调用

• 可保存常用扩增程序模板，重复使用时直接调用，减少人为设置误差。

四、不同化学体系下的程序设定

1. SYBR Green 检测体系

推荐设置（以 2× Master Mix 为例）：

• 初始变性：95℃，2–3 分钟（激活酶）

• 循环（40 次）：

• 变性：95℃，10–15 秒

• 退火/延伸：60℃，30 秒（采集荧光信号）

• 熔解曲线：60℃ 升至 95℃，每 0.3–0.5℃ 采集一次信号

特点：

• 退火与延伸可合并为一步，节省时间

• 必须进行熔解曲线分析确认特异性

2. TaqMan 探针体系

推荐设置：

• 初始变性：95℃，10 分钟

• 循环（40 次）：

• 变性：95℃，15 秒

• 退火/延伸：60℃，1 分钟（采集荧光信号）

特点：

• 无需熔解曲线分析

• 对反应体系抑制物的耐受性较好

3. 高 GC 含量模板

• 适当提高变性温度（至 98℃）并延长时间

• 退火温度可提高 2–3℃

• 可在体系中加入 DMSO、甘油等助剂，并延长延伸时间

五、扩增程序优化策略

1. 初始变性优化

• 时间过短可能导致模板未充分解链，影响首轮扩增

• 时间过长会加速酶失活

• 热启动酶通常需要 2–3 分钟激活

2. 循环参数调整

• 变性时间：10–15 秒通常足够，特殊模板可延长至 20 秒

• 退火温度：根据引物 Tm 值 ±1℃ 微调

• 延伸时间：产物<200 bp 时 30 秒即可，大于 400 bp 可延长至 60 秒

3. 荧光采集点选择

• SYBR Green 建议在延伸末期采集信号

• 探针法可在延伸过程中实时采集

• 避免在非指数期采集，防止背景信号干扰

4. 循环次数

• 一般 35–40 次，过多可能出现非特异性产物

• 病原检测可适当延长循环数提高灵敏度，但需验证特异性

六、q3 专用扩增程序设计实例

1. 标准基因表达检测（SYBR Green 法）

2. 病毒核酸检测（TaqMan 法）

七、常见扩增程序问题与解决方法

1. Ct 值不稳定

• 检查退火温度是否过低

• 确认荧光采集位置正确

• 检查移液精度

2. 熔解曲线出现多峰

• 退火温度升高 1–2℃

• 优化引物设计

• 检查污染

3. 扩增效率偏离理想值

• 调整循环时间

• 确保温控均一性

• 使用标准曲线重新验证

八、扩增程序维护与长期使用建议

• 定期校准温度模块，防止温差影响退火与延伸效率

• 保存程序模板并标注实验条件，确保重复性

• 每季度检查荧光采集模块性能，防止信号漂移

• 建立实验室扩增程序库，按样本类型分类管理

九、总结

赛默飞荧光定量PCR仪 q3 提供了灵活的扩增程序设置功能，既能满足常规基因表达分析，也能支持高灵敏度病原检测和复杂多重 PCR 任务。合理的扩增程序不仅依赖于标准参数，还需要结合实验目标、模板特性和试剂性能进行优化。通过掌握初始变性、循环条件、荧光采集点、熔解曲线等关键环节的设置方法，并在实验中不断验证和调整，能够充分发挥 q3 仪器的性能优势，获得高重复性、高特异性和高准确度的定量结果。