
赛默飞荧光定量PCR仪q3扩增程序设置
赛默飞荧光定量PCR仪 q3 扩增程序设置
一、引言
荧光定量 PCR(qPCR)是分子生物学中广泛应用的核酸定量检测技术,其结果精确性不仅取决于试剂与样本质量,还高度依赖于扩增程序的合理设定。赛默飞荧光定量PCR仪 q3 作为一款性能稳定、操作直观的设备,支持多种检测化学体系,如 SYBR Green、TaqMan 探针等。合理的扩增程序设置可确保反应的高扩增效率、良好重复性和准确的定量分析结果。
二、扩增程序的基本原理
1. qPCR 扩增过程概述
扩增程序由若干循环步骤组成,每一步温度和时间的设定直接决定了反应的特异性和效率。标准 qPCR 包含以下几个核心阶段:
初始变性(Initial Denaturation)
高温下彻底分离双链 DNA,激活热启动 DNA 聚合酶。
循环变性(Denaturation)
每一循环的高温阶段,用于分离模板链。
退火(Annealing)
引物与模板结合,温度取决于引物 Tm 值。
延伸(Extension/Elongation)
DNA 聚合酶沿着模板合成新链,同时检测荧光信号(实时监测)。
熔解曲线(Melt Curve)分析
逐步升温,分析产物特异性。
三、赛默飞 q3 仪器扩增程序界面特点
1. 界面结构
程序编辑区:以步骤为单位显示温度与时间参数,可添加、删除或调整顺序。
循环设置区:定义每组步骤的重复次数。
荧光采集设置:可选择在特定温度点采集数据,支持多通道独立设定。
2. 常用功能
温度梯度:用于退火温度优化实验。
多重 PCR 设置:支持不同通道在不同步骤采集信号。
快速程序与标准程序切换:根据酶性能和实验需求选择。
3. 保存与调用
可保存常用扩增程序模板,重复使用时直接调用,减少人为设置误差。
四、不同化学体系下的程序设定
1. SYBR Green 检测体系
推荐设置(以 2× Master Mix 为例):
初始变性:95℃,2–3 分钟(激活酶)
循环(40 次):
变性:95℃,10–15 秒
退火/延伸:60℃,30 秒(采集荧光信号)
熔解曲线:60℃ 升至 95℃,每 0.3–0.5℃ 采集一次信号
特点:
退火与延伸可合并为一步,节省时间
必须进行熔解曲线分析确认特异性
2. TaqMan 探针体系
推荐设置:
初始变性:95℃,10 分钟
循环(40 次):
变性:95℃,15 秒
退火/延伸:60℃,1 分钟(采集荧光信号)
特点:
无需熔解曲线分析
对反应体系抑制物的耐受性较好
3. 高 GC 含量模板
适当提高变性温度(至 98℃)并延长时间
退火温度可提高 2–3℃
可在体系中加入 DMSO、甘油等助剂,并延长延伸时间
五、扩增程序优化策略
1. 初始变性优化
时间过短可能导致模板未充分解链,影响首轮扩增
时间过长会加速酶失活
热启动酶通常需要 2–3 分钟激活
2. 循环参数调整
变性时间:10–15 秒通常足够,特殊模板可延长至 20 秒
退火温度:根据引物 Tm 值 ±1℃ 微调
延伸时间:产物<200 bp 时 30 秒即可,大于 400 bp 可延长至 60 秒
3. 荧光采集点选择
SYBR Green 建议在延伸末期采集信号
探针法可在延伸过程中实时采集
避免在非指数期采集,防止背景信号干扰
4. 循环次数
一般 35–40 次,过多可能出现非特异性产物
病原检测可适当延长循环数提高灵敏度,但需验证特异性
六、q3 专用扩增程序设计实例
1. 标准基因表达检测(SYBR Green 法)
步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 | 荧光采集 |
---|---|---|---|---|
初始变性 | 95 | 3 分钟 | 1 | 否 |
变性 | 95 | 15 秒 | 40 | 否 |
退火/延伸 | 60 | 30 秒 | 是 | |
熔解曲线 | 60–95 | 升温 0.3℃/步 | 1 | 是 |
2. 病毒核酸检测(TaqMan 法)
步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 | 荧光采集 |
---|---|---|---|---|
初始变性 | 95 | 10 分钟 | 1 | 否 |
变性 | 95 | 15 秒 | 45 | 否 |
退火/延伸 | 60 | 60 秒 | 是 |
七、常见扩增程序问题与解决方法
Ct 值不稳定
检查退火温度是否过低
确认荧光采集位置正确
检查移液精度
熔解曲线出现多峰
退火温度升高 1–2℃
优化引物设计
检查污染
扩增效率偏离理想值
调整循环时间
确保温控均一性
使用标准曲线重新验证
八、扩增程序维护与长期使用建议
定期校准温度模块,防止温差影响退火与延伸效率
保存程序模板并标注实验条件,确保重复性
每季度检查荧光采集模块性能,防止信号漂移
建立实验室扩增程序库,按样本类型分类管理
九、总结
赛默飞荧光定量PCR仪 q3 提供了灵活的扩增程序设置功能,既能满足常规基因表达分析,也能支持高灵敏度病原检测和复杂多重 PCR 任务。合理的扩增程序不仅依赖于标准参数,还需要结合实验目标、模板特性和试剂性能进行优化。通过掌握初始变性、循环条件、荧光采集点、熔解曲线等关键环节的设置方法,并在实验中不断验证和调整,能够充分发挥 q3 仪器的性能优势,获得高重复性、高特异性和高准确度的定量结果。
