赛默飞荧光定量PCR仪 q3 工作原理

一、引言

荧光定量 PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）是分子生物学中最重要的核酸检测与定量分析技术之一。赛默飞荧光定量PCR仪 q3 作为一款高性能实时定量 PCR 仪器，广泛应用于科研、临床、食品安全、动植物检疫等领域。其核心优势在于将 PCR 技术与荧光检测技术结合，在扩增反应进行的同时实时采集荧光信号，实现目标核酸的准确定量分析。理解 q3 的工作原理，有助于用户在实验中合理设置参数、优化条件并正确解读结果。

二、荧光定量 PCR 基本原理

1. PCR 技术原理

PCR 技术通过循环性的温度变化，利用 DNA 聚合酶在体外扩增特定核酸片段。其基本步骤包括：

1. 变性（Denaturation）：高温下使双链 DNA 分开，形成单链模板。

2. 退火（Annealing）：在较低温度下，引物与目标 DNA 单链结合。

3. 延伸（Extension）：DNA 聚合酶沿着引物方向合成新链。

经过多个循环，目标 DNA 的拷贝数呈指数级增长。

2. 荧光检测原理

荧光定量 PCR 在反应体系中加入荧光标记物（染料或探针），在扩增过程中实时采集荧光信号。荧光信号的强度与反应体系中 PCR 产物的量成正比，通过每个循环的信号变化，即可得到扩增曲线，从而计算初始模板量。

三、q3 仪器的核心工作模块

赛默飞荧光定量PCR仪 q3 的工作原理可分为 热循环控制 与 荧光信号检测 两大核心部分。

1. 热循环模块（Thermal Cycler）

• 加热与制冷系统

• 采用高精度半导体温控（Peltier 元件）和铝合金反应模块，实现快速升降温。

• 温度均一性高，保证各反应孔同步进行 PCR。

• 程序化温控

• 用户可设定每一步的温度和时间，控制变性、退火、延伸等步骤的参数。

• 支持温度梯度功能，便于优化退火温度。

2. 光学检测模块（Optical Detection System）

• 光源

• 高强度 LED 光源，提供稳定的激发光。

• 不同波长对应不同荧光通道，可支持多重检测。

• 滤光系统

• 激发滤光片：选择特定波长激发荧光染料。

• 发射滤光片：只允许目标荧光波长通过，排除杂散光。

• 检测器

• 高灵敏度光电二极管或 CCD/CMOS 相机，将荧光信号转化为电信号。

• 信号经放大与数字化后传输至数据处理系统。

四、荧光信号与 Ct 值计算

1. 荧光信号产生机制

根据检测体系不同，荧光信号的产生方式包括：

• 非特异性染料法（SYBR Green）：染料嵌入双链 DNA 时发出荧光，随产物量增加而增强。

• 特异性探针法（TaqMan、MGB 探针）：探针被聚合酶切解后释放荧光报告基团，信号与特定序列扩增直接相关。

2. Ct 值（阈值循环数）

• 软件在指数扩增阶段设定一个固定的荧光阈值。

• 样本曲线与该阈值相交时的循环数即为 Ct 值。

• Ct 值与初始模板量呈反比，模板量越多，Ct 值越小。

3. 定量方法

• 绝对定量：通过标准曲线推算样本初始拷贝数。

• 相对定量：比较目标基因与参考基因的表达量比值。

五、q3 工作过程全流程解析

1. 样品准备

• 加入 PCR 反应液，包括模板、引物、探针/染料、聚合酶、缓冲液等。

• 分装至反应板或管中，确保密封防止蒸发。

2. 反应装载与系统初始化

• 将反应板放入 q3 样品槽，关闭上盖。

• 仪器自动检测模块温度状态和光学系统。

3. 程序运行

1. 初始变性：彻底分离 DNA 链并激活热启动酶。

2. 循环扩增：

• 变性：DNA 双链解开。

• 退火：引物结合模板。

• 延伸：聚合酶合成新链，荧光信号在此阶段采集。

3. 熔解曲线分析（如适用）：升温监测荧光变化，区分特异与非特异性产物。

4. 数据采集与实时分析

• 光学系统在指定温度点采集荧光强度。

• 信号经滤波、放大、数模转换处理，绘制扩增曲线。

5. 数据输出与解释

• 软件计算 Ct 值、扩增效率、标准曲线等。

• 用户可导出报告、图表，进行统计分析。

六、q3 光学检测特点

1. 多通道检测

• 支持多种荧光染料同时检测，实现多重 PCR。

2. 灵敏度与动态范围

• 检测灵敏度可达单拷贝水平，动态范围超过 9 个数量级。

3. 低背景噪音设计

• 光学组件精密封装，减少散射光和荧光串扰。

七、影响工作原理表现的因素

1. 温控精度

• 温度不均一会导致扩增效率差异，影响 Ct 值一致性。

2. 光学对准

• 激发光与检测光路径偏差会降低信号强度。

3. 反应体系兼容性

• 缓冲液、酶体系的成分会影响荧光信号稳定性。

八、q3 的优势与局限

优势：

• 稳定的热循环性能

• 多通道灵活检测

• 高灵敏度与宽动态范围

• 用户界面友好，易于编程与数据分析

局限：

• 光学模块需要定期维护

• 高灵敏度可能放大微量污染的影响

• 不同荧光体系对温度控制的要求不同，需针对性优化

九、总结

赛默飞荧光定量PCR仪 q3 的工作原理是热循环技术与荧光检测技术的结合。通过高精度温控系统驱动核酸的循环扩增，同时利用高灵敏度光学系统实时采集荧光信号，实现核酸的高精度定量。掌握 q3 的工作机理，有助于用户优化实验设计、减少误差并提升检测的特异性与重复性，从而在科研与应用领域获得可靠的检测结果。