
赛默飞荧光定量PCR仪Q7反应体系
一、Q7荧光定量PCR反应体系原理概述
Q7荧光定量PCR仪采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time qPCR)技术,在PCR扩增过程中通过检测荧光信号变化,实现目标序列的实时定量分析。反应体系是整个技术实现的核心部分,其组成和优化直接影响扩增效率、特异性和检测灵敏度。
荧光信号的来源通常有两类:
非特异性染料法(如SYBR Green I):与所有双链DNA结合,通过产物累积产生荧光增强。
特异性探针法(如TaqMan探针、MGB探针):利用特异性探针与靶序列结合并在扩增中被切割释放荧光基团,实现更高特异性检测。
二、反应体系的主要组成部分
1. 缓冲液(Buffer)
缓冲液为PCR反应提供合适的pH和离子强度环境。常用成分包括:
Tris-HCl(维持稳定pH值)
KCl 或 (NH₄)₂SO₄(优化引物结合效率)
MgCl₂(Taq酶的必需辅因子,浓度对扩增效率影响显著)
在Q7中,缓冲体系一般由商业试剂盒提供,并针对不同染料/探针体系优化。
2. 二价金属离子(Mg²⁺)
Mg²⁺浓度影响DNA聚合酶活性和引物结合稳定性。浓度过低会降低产量,过高则可能增加非特异性扩增和引物二聚体形成。典型范围:1.5–3.0 mM,需要根据模板复杂度和引物设计调整。
3. dNTP混合物
由dATP、dTTP、dCTP和dGTP等组成,通常等摩尔配比(200 μM 每种)。浓度过低会降低扩增效率,过高可能增加突变率。
4. 引物(Primers)
长度:18–25 bp
GC含量:40–60%
熔解温度(Tm):通常在58–62℃范围
避免二聚体、发夹结构和互补区
SYBR Green法要求引物特异性更高,探针法可适当放宽,但仍需避免交叉结合
5. 探针(Probes,适用于探针法)
TaqMan探针:5’端标记荧光基团,3’端标记淬灭基团,特异性结合靶序列并在扩增过程中被切割释放荧光信号
MGB探针:在3’端加分子内锁,提高结合稳定性,适合短探针设计
荧光基团与检测通道匹配(FAM、VIC、ROX、Cy5等)
6. DNA聚合酶
Hot-start Taq酶:在高温下活化,可减少非特异性扩增
对于RNA模板,还需逆转录酶(One-Step RT-qPCR)
7. 模板DNA或cDNA
高纯度、无抑制物(如蛋白质、酚、乙醇残留)
浓度适宜,过高或过低均会影响Ct值稳定性
8. 荧光参考染料
如ROX(Passive Reference Dye),用于校正因加样体积或光路差异带来的荧光波动
三、Q7典型反应体系配比参考(20 μL体系)
组分 | 终浓度/用量 | 功能说明 |
---|---|---|
2× Master Mix | 10 μL | 含缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、Taq酶等 |
上游引物(10 μM) | 0.4 μL(0.2 μM) | 扩增起始点 |
下游引物(10 μM) | 0.4 μL(0.2 μM) | 扩增终止点 |
探针(10 μM) | 0.2 μL(0.1 μM) | 特异性荧光检测(仅探针法) |
模板DNA/cDNA | 1–2 μL | 待检测目标序列 |
无RNA酶水 | 补足至20 μL | 稀释及反应体系补足 |
说明:具体配比需根据试剂说明书与实验优化结果调整。
四、反应体系优化策略
1. Mg²⁺浓度优化
通过梯度试验(如1.5、2.0、2.5、3.0 mM)筛选最佳浓度,平衡扩增效率与特异性。
2. 引物与探针浓度优化
高浓度引物可能产生非特异性扩增,低浓度可能导致Ct值偏高;探针浓度过高会增加背景信号。常用优化梯度:引物0.1–0.5 μM,探针0.05–0.25 μM。
3. 退火温度优化
退火温度过低增加非特异性,过高可能降低扩增效率。可在55–65℃范围内进行梯度优化。
4. 反应体系选择
SYBR Green法:体系简洁、成本低,但需严格溶解曲线分析
探针法:特异性高、可多重检测,但成本高
五、反应体系的质量控制
阴性对照(NTC):无模板反应,排除污染
阳性对照:验证体系与程序正确性
内参基因:校正样品间差异(如GAPDH、ACTB等)
重复孔检测:提高数据可靠性
六、在Q7上的多重反应体系设计
Q7支持多通道荧光检测,可同时检测多个目标。多重体系设计要点:
各目标基因的扩增效率相近
荧光染料光谱不重叠
引物与探针无交叉配对
七、实例应用
1. 病原体检测
病毒RNA提取→One-Step RT-qPCR
使用特异性探针(FAM通道)检测病毒基因
ROX作参考染料,确保Ct值稳定
2. 基因表达分析
RNA逆转录生成cDNA
SYBR Green体系,检测目标基因与内参基因
ΔΔCt法计算相对表达量
3. 基因突变检测
设计等位基因特异性探针
Q7多通道分别监测野生型与突变型信号
八、结论
Q7荧光定量PCR仪的反应体系设计是实现高质量数据的关键。合理的组分配比、严格的优化策略和全面的质量控制,能最大化发挥Q7的灵敏度、特异性与稳定性。通过对缓冲液、Mg²⁺、引物、探针、酶及模板的科学管理,结合多通道荧光检测优势,Q7能够在病原检测、基因表达、遗传分析等领域提供可靠、可重复的实验数据。
