赛默飞荧光定量PCR仪Q7反应体系
一、Q7荧光定量PCR反应体系原理概述
Q7荧光定量PCR仪采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-Time qPCR）技术，在PCR扩增过程中通过检测荧光信号变化，实现目标序列的实时定量分析。反应体系是整个技术实现的核心部分，其组成和优化直接影响扩增效率、特异性和检测灵敏度。
荧光信号的来源通常有两类：
非特异性染料法（如SYBR Green I）：与所有双链DNA结合，通过产物累积产生荧光增强。
特异性探针法（如TaqMan探针、MGB探针）：利用特异性探针与靶序列结合并在扩增中被切割释放荧光基团，实现更高特异性检测。
二、反应体系的主要组成部分
1. 缓冲液（Buffer）
缓冲液为PCR反应提供合适的pH和离子强度环境。常用成分包括：
Tris-HCl（维持稳定pH值）
KCl 或 (NH₄)₂SO₄（优化引物结合效率）
MgCl₂（Taq酶的必需辅因子，浓度对扩增效率影响显著）
在Q7中，缓冲体系一般由商业试剂盒提供，并针对不同染料/探针体系优化。
2. 二价金属离子（Mg²⁺）
Mg²⁺浓度影响DNA聚合酶活性和引物结合稳定性。浓度过低会降低产量，过高则可能增加非特异性扩增和引物二聚体形成。典型范围：1.5–3.0 mM，需要根据模板复杂度和引物设计调整。
3. dNTP混合物
由dATP、dTTP、dCTP和dGTP等组成，通常等摩尔配比（200 μM 每种）。浓度过低会降低扩增效率，过高可能增加突变率。
4. 引物（Primers）
长度：18–25 bp
GC含量：40–60%
熔解温度（Tm）：通常在58–62℃范围
避免二聚体、发夹结构和互补区
SYBR Green法要求引物特异性更高，探针法可适当放宽，但仍需避免交叉结合
5. 探针（Probes，适用于探针法）
TaqMan探针：5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，特异性结合靶序列并在扩增过程中被切割释放荧光信号
MGB探针：在3’端加分子内锁，提高结合稳定性，适合短探针设计
荧光基团与检测通道匹配（FAM、VIC、ROX、Cy5等）
6. DNA聚合酶
Hot-start Taq酶：在高温下活化，可减少非特异性扩增
对于RNA模板，还需逆转录酶（One-Step RT-qPCR）
7. 模板DNA或cDNA
高纯度、无抑制物（如蛋白质、酚、乙醇残留）
浓度适宜，过高或过低均会影响Ct值稳定性
8. 荧光参考染料
如ROX（Passive Reference Dye），用于校正因加样体积或光路差异带来的荧光波动
三、Q7典型反应体系配比参考（20 μL体系）
| 组分 | 终浓度/用量 | 功能说明 |
|---|---|---|
| 2× Master Mix | 10 μL | 含缓冲液、Mg²⁺、dNTPs、Taq酶等 |
| 上游引物（10 μM） | 0.4 μL（0.2 μM） | 扩增起始点 |
| 下游引物（10 μM） | 0.4 μL（0.2 μM） | 扩增终止点 |
| 探针（10 μM） | 0.2 μL（0.1 μM） | 特异性荧光检测（仅探针法） |
| 模板DNA/cDNA | 1–2 μL | 待检测目标序列 |
| 无RNA酶水 | 补足至20 μL | 稀释及反应体系补足 |
说明：具体配比需根据试剂说明书与实验优化结果调整。
四、反应体系优化策略
1. Mg²⁺浓度优化
通过梯度试验（如1.5、2.0、2.5、3.0 mM）筛选最佳浓度，平衡扩增效率与特异性。
2. 引物与探针浓度优化
高浓度引物可能产生非特异性扩增，低浓度可能导致Ct值偏高；探针浓度过高会增加背景信号。常用优化梯度：引物0.1–0.5 μM，探针0.05–0.25 μM。
3. 退火温度优化
退火温度过低增加非特异性，过高可能降低扩增效率。可在55–65℃范围内进行梯度优化。
4. 反应体系选择
SYBR Green法：体系简洁、成本低，但需严格溶解曲线分析
探针法：特异性高、可多重检测，但成本高
五、反应体系的质量控制
阴性对照（NTC）：无模板反应，排除污染
阳性对照：验证体系与程序正确性
内参基因：校正样品间差异（如GAPDH、ACTB等）
重复孔检测：提高数据可靠性
六、在Q7上的多重反应体系设计
Q7支持多通道荧光检测，可同时检测多个目标。多重体系设计要点：
各目标基因的扩增效率相近
荧光染料光谱不重叠
引物与探针无交叉配对
七、实例应用
1. 病原体检测
病毒RNA提取→One-Step RT-qPCR
使用特异性探针（FAM通道）检测病毒基因
ROX作参考染料，确保Ct值稳定
2. 基因表达分析
RNA逆转录生成cDNA
SYBR Green体系，检测目标基因与内参基因
ΔΔCt法计算相对表达量
3. 基因突变检测
设计等位基因特异性探针
Q7多通道分别监测野生型与突变型信号
八、结论
Q7荧光定量PCR仪的反应体系设计是实现高质量数据的关键。合理的组分配比、严格的优化策略和全面的质量控制，能最大化发挥Q7的灵敏度、特异性与稳定性。通过对缓冲液、Mg²⁺、引物、探针、酶及模板的科学管理，结合多通道荧光检测优势，Q7能够在病原检测、基因表达、遗传分析等领域提供可靠、可重复的实验数据。
