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赛默飞荧光定量PCR仪Q7使用流程

赛默飞荧光定量PCR仪 Q7 是一款集高精度温控系统与多通道荧光检测技术于一体的实时定量 PCR 平台,适用于基因定量分析、病原体检测、遗传变异分析等分子生物学实验。为了确保实验结果准确、可重复且高效,本使用流程将从实验准备到结果分析的各个环节进行系统化讲解。

一、实验准备

在启动任何 PCR 反应之前,需要完成充分的准备工作,以确保实验的准确性和安全性。

  1. 仪器状态检查

    • 确认 Q7 主机电源正常连接,显示面板无报警提示。

    • 检查温控模块表面是否干净平整,无试剂残留或物理损伤。

    • 检查光学检测窗是否清洁透明,无灰尘或指纹污渍。

  2. 环境条件确认

    • 实验室温度保持在 18–28℃,相对湿度低于 70%。

    • 确保实验台面干净、干燥且远离强烈振动源。

  3. 试剂与耗材准备

    • 按照实验方案准备 PCR 缓冲液、引物、探针、荧光染料及模板 DNA/RNA。

    • 使用经灭菌处理的无酶耗材(如 PCR 管、反应板、移液枪头)。

    • 所有试剂在使用前充分解冻并混匀,避免反复冻融。

  4. 个人防护

    • 穿戴实验服、一次性手套和护目镜。

    • 在无 RNA 酶、无 DNA 酶的环境中操作,防止样品降解或污染。


二、反应体系配置

反应体系的准确配置是确保扩增成功的基础。

  1. 反应体积与浓度

    • 常规反应总体积为 10–50 μL,具体根据试剂说明与检测需求确定。

    • 引物浓度一般为 0.1–0.5 μM,探针浓度为 0.05–0.25 μM。

  2. 反应液配置步骤

    • 按试剂盒或实验方案要求将各组分加入无酶水中,最后加入模板核酸。

    • 避免直接在反应管中加入高浓度模板,可先在单独管中混匀反应液。

  3. 混匀与离心

    • 配置完成后轻轻混匀,可使用涡旋仪低速震荡。

    • 微量离心机中短暂离心,确保液体集中在管底,避免气泡影响光学检测。


三、样品装载

Q7 PCR 仪支持多种样品装载形式,包括 96 孔板和单管模式。

  1. 加样原则

    • 在冰上操作,减少核酸降解风险。

    • 避免产生气泡,必要时使用无气泡移液技巧。

  2. 封板与密封

    • 使用光学透明封板膜,确保密封严实,防止蒸发与污染。

    • 检查密封膜表面是否平整无皱褶,避免干扰光学信号。

  3. 放置样品

    • 将反应板放置于样品槽内,位置准确对齐,避免倾斜。

    • 样品放置完成后轻轻关闭压盖装置,避免用力过度造成损坏。


四、程序设定

Q7 的温控与检测程序通过配套软件进行设定,用户可根据实验方案自定义循环条件。

  1. 建立新实验文件

    • 输入实验名称、日期、操作者等信息,便于后续数据管理

    • 选择检测模式(SYBR Green 或 TaqMan 探针法)。

  2. 温度循环设置

    • 设定预变性(如 95℃,30 秒)、变性(95℃,5–10 秒)、退火/延伸(58–62℃,20–40 秒)等步骤。

    • 循环次数通常设定为 35–45 次,根据检测灵敏度要求调整。

  3. 荧光采集设置

    • 指定荧光采集通道及采集时间点(通常在延伸阶段末端)。

    • 多重检测时为每种荧光标记选择合适的通道。

  4. 熔解曲线分析(适用于 SYBR Green)

    • 设定升温速率和范围(如 65–95℃,每步 0.3℃),用于检测产物特异性。


五、运行与监控

启动程序后,Q7 会自动执行温控和光学采集过程。

  1. 实时监控

    • 软件界面可实时显示扩增曲线的变化趋势。

    • 观察基线与指数期的信号变化,确保无异常波动。

  2. 异常处理

    • 如果发现某通道信号明显异常,应立即暂停运行并检查样品或光学模块。

    • 避免在运行过程中频繁开启仪器盖板,以免影响温控稳定性。


六、结果分析

实验完成后,软件会自动生成数据文件,用户可进行多种分析。

  1. Ct 值分析

    • 确定每个样品的循环阈值(Ct),作为定量分析的基础。

    • 对标准品绘制标准曲线,计算扩增效率。

  2. 熔解曲线分析

    • 单一峰值代表产物特异性好,多峰值提示可能存在非特异扩增。

  3. 多重检测数据处理

    • 分别分析各通道数据,确保不同荧光信号无交叉干扰。


七、数据管理与导出

  1. 保存实验文件

    • 建议按日期、实验类型和操作者命名文件,便于检索。

    • 备份至独立硬盘或实验室服务器。

  2. 数据导出

    • 支持导出 Ct 值表格、扩增曲线图、熔解曲线图等多种格式。

    • 可选择导出为 Excel、PDF 或图像文件,用于后续分析或报告。


八、实验收尾与清洁

  1. 取出样品

    • 戴手套取出反应板或管,按照生物安全规程处理。

    • 废弃物放入专用核酸废弃物容器中。

  2. 清洁样品槽与光学模块

    • 使用无尘布蘸取去离子水擦拭样品槽表面。

    • 检查光学检测窗,必要时使用光学清洁纸轻拭。

  3. 关闭仪器

    • 退出软件,安全关机。

    • 覆盖防尘罩,保持设备清洁。


九、使用流程优化建议

  • 缩短准备时间:提前配置好反应液的母液,减少每次加样的步骤。

  • 提升检测一致性:固定加样顺序和时间,减少操作误差。

  • 多重检测优化:选择光谱分离度高的荧光染料,避免信号干扰。

  • 减少污染风险:建立独立的反应体系配置区和样品检测区。


十、结语

赛默飞荧光定量PCR仪 Q7 具备高精度温控、灵敏的多通道光学检测以及强大的数据分析能力,适用于多种分子检测任务。通过遵循上述使用流程,操作者不仅可以确保实验的准确性和稳定性,还能在长期使用中维持仪器的最佳性能。严格执行标准化流程是获得可靠、可重复科研数据的前提,也是保障实验室检测质量的重要环节。