1. 仪器概述

赛默飞荧光定量PCR仪Q7采用先进的光学系统、温控技术及强大的数据分析功能，能够实时监测PCR反应中的DNA扩增过程。Q7支持单重PCR和多重PCR，适用于高通量实验，能够同时处理多个样本。其光学系统支持多通道荧光信号检测，提供极高的灵敏度和精确度，保证实验结果的可靠性。

Q7仪器的核心优势在于其高精度的温控系统和实时荧光检测功能，能够在每个PCR循环中精准控制温度，实时监控荧光信号的变化，为基因定量分析提供准确的数据支持。

2. 仪器准备

2.1 电源和接口

在使用Q7荧光定量PCR仪之前，需要确保仪器已正确连接电源，并开启电源开关。仪器还配备了多种接口，包括USB接口、网络接口等，便于连接外部设备和进行数据导出。

2.2 安装与校准

在使用Q7仪器之前，首先需要对仪器进行必要的安装和校准。仪器出厂时已经进行了基本的校准，但在长期使用过程中，定期的校准工作可以确保仪器性能的稳定性。在操作界面上，用户可以通过软件设置进行自动校准，确保光学系统和温控系统的精确性。

2.3 启动与初始化

启动仪器时，打开电源开关并等待仪器自检完成。Q7仪器的自检过程包括检查光学系统、温控系统以及传感器等硬件的正常运行。在启动过程中，仪器会进行一些初始化设置，如校准光学系统、温控系统以及读取实验数据等。仪器自检完成后，用户可以通过触摸屏界面或电脑客户端进入仪器的主操作界面。

3. 实验准备

3.1 样品制备

在进行荧光定量PCR实验时，首先需要准备好PCR反应体系。反应体系的成分包括：DNA模板、引物、荧光探针或染料、dNTPs、缓冲液、DNA聚合酶等。每个反应体系的配置需根据实验的具体要求进行调整。

• DNA模板：用于PCR扩增的模板DNA应根据实验需求进行提取。根据目标基因的不同，DNA的浓度应进行适当调整，通常浓度范围在10-100 ng/μL。

• 引物设计：引物是PCR反应中的关键因素，正确设计的引物能够确保扩增的特异性。在选择引物时，应考虑引物的长度、GC含量以及是否存在二聚体或发卡结构等问题。

• 荧光染料/探针：在Q7仪器中，常用的荧光标记物包括SYBR Green、TaqMan探针、Molecular Beacons等。选择合适的荧光染料或探针对于实验的准确性至关重要。

3.2 PCR反应设置

根据样品和实验设计，设置适当的PCR反应体系。典型的PCR反应体系包含以下成分：

• DNA模板：根据样本浓度的不同，通常加入1-5 μL模板。

• 引物：引物浓度通常为0.2-1 μM。

• 荧光染料/探针：根据选择的荧光染料或探针，设定适当的浓度。

• PCR缓冲液：通常使用10X缓冲液，Mg2+浓度根据实验需要进行调整。

• dNTPs：dNTP的浓度一般为0.2 mM。

• DNA聚合酶：一般选择热稳定型聚合酶，浓度通常为0.025-0.05 U/μL。

在配置好反应体系后，将其分配到PCR管或PCR板中，准备好后放入Q7荧光定量PCR仪进行反应。

3.3 反应板和管的选择

Q7荧光定量PCR仪支持多种类型的PCR反应板，如96孔板、384孔板等。根据实验的样本量和检测需求，选择合适的PCR反应板。对于96孔板，每孔可进行单重PCR或多重PCR实验。在使用多孔板时，务必确保样品的分配均匀，避免由于孔位不均导致实验结果的不一致。

4. 实验操作

4.1 程序设置

进入Q7仪器的操作界面后，选择适合的PCR程序进行设置。Q7提供了多种预设的实验程序，用户可以根据实验要求进行选择，也可以根据需要自定义实验程序。常见的PCR程序包括：

• 变性阶段：通常设置在95°C，保持10-30秒，用于分离DNA双链。

• 退火阶段：根据引物的Tm值设置退火温度，通常为50-65°C，时间为10-30秒。

• 延伸阶段：一般设置在72°C，时间根据模板长度调整，通常为30秒至1分钟。

• 循环次数：一般设置30-40个循环，具体的循环次数取决于模板的起始浓度和扩增目标。

Q7提供灵活的程序设置选项，用户可以根据实验的实际情况调整每个步骤的时间和温度参数。同时，Q7支持梯度温控，能够在不同孔位设置不同的退火温度，以优化引物退火条件。

4.2 启动PCR反应

完成程序设置后，点击“启动”按钮，Q7将开始执行PCR反应。在反应过程中，仪器将自动调节温控系统，确保各阶段的温度保持稳定。此外，Q7通过其高精度的光学系统实时监控PCR反应中的荧光信号。实验过程中，荧光信号将根据DNA扩增的情况实时变化，Q7会记录每个循环的荧光强度，并将数据保存在仪器的数据库中。

4.3 实时数据监控

Q7仪器配备了实时数据监控功能，用户可以通过触摸屏或连接的电脑客户端查看PCR反应过程中的实时数据。实验过程中，仪器会实时显示各个样本的荧光信号变化曲线，并计算每个样本的Ct值（阈值循环数）。用户可以根据实时数据判断PCR反应是否正常进行，如信号是否稳定，是否出现非特异性扩增等问题。

5. 数据分析

5.1 标准曲线分析

Q7提供强大的数据分析功能，包括标准曲线分析、基因表达定量、Ct值分析等。通过设置已知浓度的标准样本，仪器能够生成标准曲线，并根据标准曲线计算实验样本的DNA浓度。在定量PCR实验中，标准曲线的拟合度（R²值）应接近1，确保结果的准确性。

5.2 基因表达定量

Q7还支持基因表达定量分析，用户可以通过计算目标基因和内参基因的相对表达量，得到基因表达的变化情况。仪器内置的分析软件支持多种数据分析模式，包括ΔΔCt法、绝对定量法等。

5.3 数据导出与报告生成

实验完成后，用户可以将实验数据导出为Excel、CSV等格式，便于后续的数据处理和分析。同时，Q7提供自动报告生成功能，能够根据实验结果生成详细的分析报告，报告内容包括Ct值、标准曲线、扩增效率等信息。

6. 常见问题及解决方法

6.1 PCR反应未产生信号

• 检查DNA模板的质量和浓度是否合适。

• 检查引物的设计是否合理。

• 检查PCR反应体系中的成分，如酶、dNTPs、缓冲液等是否配制正确。

• 确保PCR程序的温度和时间设置正确。

6.2 非特异性扩增

• 检查引物的特异性，是否有二聚体或发卡结构。

• 调整退火温度，确保引物与模板的结合特异性。

• 检查PCR反应体系中的Mg2+浓度，过高或过低可能影响特异性扩增。

6.3 荧光信号背景过高

• 确保荧光染料或探针的浓度适宜，过高或过低都可能导致信号问题。

• 检查PCR反应板是否有污染，保持良好的实验室操作规范。

7. 结论

赛默飞荧光定量PCR仪Q7是一款功能强大、性能稳定的分子生物学实验设备，适用于各种基因定量分析应用。通过正确的使用和操作，研究人员能够实现高灵敏度、高精度的实验结果。掌握仪器的操作流程、实验设置和数据分析方法，将有助于提高实验效率，确保实验数据的准确性和可靠性。