宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P详细步骤

一、实验概述

宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P是一款中通量的实时荧光定量PCR系统，具有体积小巧、操作简便、检测灵敏度高的特点，适合中小型实验室或临床科室使用。与96通量机型相比，SLAN-48P在保持性能稳定的同时更注重操作效率和节省试剂。为了确保实验顺利进行，以下将对实验步骤进行详细说明。

二、实验前准备

1. 实验室环境

• 温度保持在18–30℃之间，湿度控制在30%–80%。

• 实验台面需坚固、防震，避免靠近强电磁干扰设备。

• 保持空气流通，避免灰尘堆积，确保环境洁净。

2. 仪器检查

• 确认SLAN-48P放置平稳，通风口畅通。

• 检查电源线和通信线连接牢固。

• 打开电源开关，观察自检过程是否正常。

• 确认软件能正常识别仪器。

3. 耗材与试剂

• 耗材：48孔专用反应管、光学透明盖或封膜。

• 试剂：定量PCR预混液、dNTP、Taq酶、荧光染料或探针。

• 样品：提取后的DNA或RNA，RNA需先反转录为cDNA。

4. 对照体系

• 阴性对照：不含模板，仅含体系。

• 阳性对照：含标准模板，验证体系是否有效。

• 重复设置：建议每个样品设置至少两个重复孔。

三、反应体系配置

1. 配制方法

• 在洁净区内操作，避免污染。

• 使用移液器依次加入反应体系各组分。常见体系为20µL：

• 预混液：10µL

• 上游引物：0.5µL

• 下游引物：0.5µL

• 探针或荧光染料：0.5–1µL

• 模板：2–5µL

• ddH₂O补足至20µL

2. 注意事项

• 加样需轻柔，避免产生气泡。

• 配置后使用离心机短暂离心，使液体沉底。

• 加样过程中每次更换吸头，防止交叉污染。

四、软件设置与实验建立

1. 新建实验

• 打开配套软件，点击“新建实验”。

• 输入实验名称、操作者姓名和保存路径。

• 可设置标签，方便后续查找。

2. 循环参数设置

• 初始变性：95℃，2–3分钟。

• 循环阶段：

• 变性：95℃，10–15秒；

• 退火：55–65℃，20–30秒；

• 延伸：72℃，20–30秒。

• 循环次数：35–45次，根据实验需求设定。

• 荧光采集点：一般设置在退火或延伸阶段。

3. 荧光通道分配

• 软件支持多通道检测，如FAM、HEX、ROX、CY5。

• 根据实验方案为不同靶标分配通道。

• 每个孔位可同时设定一个或多个通道。

4. 样品布局

• 在软件界面中点击48孔反应布局图，逐一输入样品名称。

• 标记阴性、阳性对照，避免分析时混淆。

• 可以使用颜色标注不同组别。

五、样品装载与实验运行

1. 样品装载

• 将配置好的反应管或反应板轻放入样品仓。

• 检查放置方向是否正确。

• 关闭并锁紧舱盖，避免实验中途蒸发或泄漏。

2. 启动实验

• 在软件中点击“开始运行”。

• 仪器进入自动加热循环并采集荧光信号。

• 实验期间软件显示实时扩增曲线，便于监控。

六、实验监控与实时观察

1. 扩增曲线实时显示

• 在反应进行中，曲线逐渐上升。

• 阳性对照应在预期Ct范围内出现曲线。

• 阴性对照应无明显信号。

2. 温度曲线监控

• 软件显示当前循环的温度变化曲线。

• 控温精度决定扩增结果可靠性。

3. 状态栏提示

• 实时显示运行进度、剩余时间、循环次数。

• 若出现异常，软件会报警提示。

七、实验结束与数据分析

1. 扩增曲线解读

• 典型扩增曲线：S型，基线稳定，指数增长明显。

• 异常曲线：平直或波动，需排查原因。

2. Ct值计算

• 软件自动识别阈值线，计算Ct值。

• 用户可根据曲线状态手动调整阈值。

3. 标准曲线分析

• 使用不同浓度标准模板建立标准曲线。

• 输出相关系数R²和扩增效率。

• R²≥0.98，效率90%–110%为理想值。

4. 熔解曲线分析

• 单峰表示产物特异性好。

• 多峰或拖尾提示存在非特异性扩增或引物二聚体。

5. 数据导出

• 支持Excel、PDF、Word、图片格式导出。

• 报告包含Ct值表格、扩增曲线、熔解曲线、标准曲线。

八、常见问题及解决办法

1. Ct值过高或无信号

• 模板量不足或降解。

• 试剂失效或配比错误。

• 热循环参数不合理。

2. 熔解曲线出现杂峰

• 说明有非特异性扩增。

• 解决方法：优化退火温度，重新设计引物。

3. 重复性差

• 加样体积不一致，操作不规范。

• 封膜不严导致蒸发。

4. 软件异常

• 检查通信线缆。

• 关闭电源与软件，重新启动。

九、维护与保养

1. 实验结束后

• 取出反应管，妥善处理废弃物。

• 用无水乙醇清洁样品仓。

2. 日常维护

• 定期检查电源和散热系统。

• 保持仪器外表清洁，防止灰尘积聚。

3. 光学系统维护

• 定期擦拭光学检测窗口，避免污染影响检测。

• 不可使用腐蚀性清洁剂。

4. 长期停机

• 切断电源，覆盖防尘布。

• 存放环境干燥通风，避免潮湿损坏。

十、应用拓展

SLAN-48P的实验步骤适用于多种分子检测场景：

• 临床检测：新冠病毒、流感病毒、结核分枝杆菌核酸检测。

• 基因研究：基因分型、SNP检测、突变筛查。

• 肿瘤学：基因突变与融合检测。

• 食品安全：转基因成分检测、致病菌监控。

• 药物研发：基因表达定量，药物作用机制研究。

十一、总结

宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P以其便捷的操作流程和高灵敏度检测能力，为科研和临床实验提供了可靠工具。从实验前准备到结果分析，每一步都需要严格遵循规范。通过标准化的操作流程，实验者能够获得准确、可重复的结果。与此同时，合理维护和正确使用也能延长仪器使用寿命，使其在分子检测领域发挥长期价值。