博日荧光定量PCR仪 FQD-16B 运行流程详解

一、设备概述

博日荧光定量PCR仪 FQD-16B 是一款小型实时荧光定量PCR仪，配备16孔位检测通量，适用于中小规模实验。它结合了高精度温控系统和灵敏的光学检测模块，能够实时采集扩增过程中产生的荧光信号，并生成扩增曲线和熔解曲线。该设备常用于基因表达定量、病原体检测、突变筛查、食品安全分析等领域。

FQD-16B 的优势在于操作简便、结果可靠、体积小巧，非常适合科研实验室和临床检测机构的日常使用。为了确保获得准确结果，需要遵循完整而规范的运行流程。

二、运行前准备

1. 仪器检查

• 电源：确保电源线、插座接触良好，电压稳定。

• 温控系统：检查温控模块是否完好，无损坏或异常噪音。

• 光学系统：确认光学通道干净，无灰尘和污染。

• 软件：检查控制软件是否正常运行，版本是否最新。

2. 实验环境

• 温度保持在 18℃–30℃，避免剧烈波动。

• 相对湿度保持在 30%–70%。

• 避免直射阳光和强烈振动。

• 保持实验室空气清洁，减少灰尘和化学气体干扰。

3. 试剂与耗材准备

• 模板：提取并纯化的 DNA 或 RNA。若为 RNA，需要先进行反转录生成 cDNA。

• 引物与探针：根据实验设计提前准备，需验证特异性。

• 试剂：PCR 酶、dNTP、缓冲液、Mg²⁺ 溶液、荧光染料。

• 耗材：专用PCR管或16孔反应板，封板膜或管盖，低吸附枪头。

三、反应体系配置

1. 配制步骤

在无污染的工作区配置反应体系：

• 模板DNA/cDNA：1–2 μL

• 正反向引物：0.2–0.4 μM

• 探针/荧光染料：根据体系要求添加

• dNTP混合液：0.2 mM

• 缓冲液：1×

• DNA聚合酶：0.5–1 U

• 无核酸水：补足至最终体积（常见为20 μL）

2. 注意事项

• 避免气泡产生，以免影响光学检测。

• 体系分装应均匀，避免孔间差异。

• 配置完毕后立即封板，防止蒸发和污染。

四、样品加载与布局

• 将反应管或反应板放置于仪器样品槽中，确保位置正确。

• 对照样本必须设置，包括阳性对照、阴性对照和无模板对照。

• 若进行多靶标检测，应合理安排通道，避免交叉干扰。

五、运行程序设定

1. 基本循环设置

典型程序包括：

• 初始变性：95℃，2–3 分钟。

• 循环（35–45次）：

• 变性：95℃，10–15 秒

• 退火/延伸：55–65℃，30 秒（同时采集荧光信号）

2. 熔解曲线分析

若需要进行熔解曲线分析，程序一般设定为：

• 从65℃开始，逐步升温至95℃。

• 升温速率为0.1℃–0.5℃/秒。

• 在升温过程中持续采集荧光信号。

3. 软件操作

• 输入样本编号、实验分组信息。

• 设定荧光通道和检测模式。

• 保存程序文件，确保可重复使用。

六、实验运行与实时监控

1. 实验运行

点击“运行”后，仪器自动执行设定的循环程序，并在每个循环末端采集荧光信号。

2. 实时监控

• 扩增曲线：实时显示样本扩增情况。理想曲线应为典型的S型。

• 荧光信号：应随循环数增加而逐步增强。

• 温度监控：温控模块实时保持设定温度，确保反应稳定。

3. 异常检测

若出现异常曲线或信号，应立即暂停实验，检查反应体系与样本配置。

七、实验结束与数据处理

1. 数据自动分析

实验完成后，软件会自动生成以下结果：

• Ct值（循环阈值）。

• 扩增曲线图。

• 熔解曲线图（若设置）。

• 标准曲线（若有标准品）。

2. 数据输出

结果可导出为多种格式：

• PDF：适合归档和打印。

• Excel：适合进一步数据统计分析。

• Word：适合科研论文或报告编辑。

3. 结果判读

• 阴性对照：应无扩增信号，否则可能存在污染。

• 阳性对照：应有稳定Ct值，证明反应体系有效。

• 实验样本：Ct值和曲线应在合理范围，且与对照组对比符合预期。

八、常见问题与解决方法

1. 无扩增曲线

• 模板降解或浓度过低。

• 试剂失效。

• 反应条件设置错误。

2. 非特异性扩增

• 退火温度过低。

• 引物设计不合理。

• 循环次数过多。

3. Ct值过高

• 模板量不足。

• 样本中存在抑制剂。

• 荧光探针或染料浓度不合适。

4. 熔解曲线异常

• 产物杂质多或有引物二聚体。

• 升温速率不合理。

九、设备维护与优化

1. 日常维护

• 使用后擦拭样品槽，避免液体残留。

• 定期清洁光学窗口，防止灰尘影响检测。

• 每周运行一次自检程序，确保功能正常。

2. 定期校准

• 温控模块校准：确保各孔温度均一。

• 光学系统校准：保持检测信号一致性。

3. 软件升级

• 定期检查软件更新，获取优化算法和新功能。

十、未来发展趋势

1. 自动化与智能化

未来FQD系列仪器将更多引入自动化样本加载和人工智能数据分析，减少人为操作差异。

2. 云端数据共享

运行数据可直接上传云平台，实现远程监控与团队共享。

3. 多重检测能力提升

支持更多荧光通道，实现一次检测多个靶标。

4. 与数字PCR结合

结合数字PCR的高精度，实现更宽的动态范围与更低的检测限。

十一、结论

博日荧光定量PCR仪 FQD-16B 的运行流程涵盖了从准备、体系配置、程序设定、实验运行、实时监控到数据分析与报告输出的完整链条。严格遵守流程不仅能保证实验结果的准确性和可靠性，还能延长设备寿命，提高实验室的整体工作效率。随着智能化与自动化的发展，未来运行流程将更加高效和便捷，为科研与临床检测提供更有力的支持。