宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P实验原理
一、引言
聚合酶链式反应（PCR）自20世纪80年代问世以来，极大地推动了分子生物学和临床诊断的发展。实时荧光定量PCR（qPCR）则在此基础上，通过实时监测扩增过程中的荧光信号，实现了核酸分子的定量检测。宏石SLAN-48P是宏石公司推出的一款中等通量的实时荧光定量PCR设备，适用于临床检测、科研实验、食品安全和环境监测等领域。其实验原理是PCR扩增循环与荧光探针检测的有机结合，依托精确的温控系统和高灵敏光学检测，实现核酸扩增的可视化与定量化。
二、PCR扩增基本原理
1. PCR循环机制
PCR反应依靠耐高温的DNA聚合酶，在温度循环条件下完成DNA片段的指数扩增。其核心步骤包括：
变性（Denaturation）：在94–95℃条件下，使双链DNA解链成单链。
退火（Annealing）：在50–65℃条件下，引物与模板DNA互补结合。
延伸（Extension）：在72℃条件下，DNA聚合酶利用dNTP合成新链。
一个循环结束后目标序列数量理论上翻倍。经过30–40个循环，可以将极少量的DNA扩增到足够检测的水平。
2. 扩增的指数特征
PCR在指数期产物累积速度最快，理论倍增，但受限于酶活性衰减、底物耗竭和副反应干扰，后期曲线会进入平台期。
三、实时荧光定量PCR原理
1. 实时检测机制
实时荧光定量PCR不同于传统PCR的事后检测，它在扩增过程中实时采集荧光信号，通过曲线变化来判断核酸扩增情况。这使得结果更加直观，并支持定性与定量分析。
2. 荧光信号与核酸扩增关系
荧光染料或探针与扩增产物结合后发光，荧光强度与核酸浓度成正比。通过监测荧光强度随循环数的变化，可以判断：
目标序列是否存在；
不同样品中模板含量的差异；
根据标准曲线计算核酸的拷贝数。
3. 常用荧光检测方式
SYBR Green I染料：可与双链DNA结合，经济实用，但易受非特异性产物干扰。
TaqMan探针：利用荧光基团与淬灭基团的分离实现信号释放，特异性高。
分子信标与FRET探针：通过能量转移实现多重检测，适用于复杂实验设计。
四、SLAN-48P实验原理
1. 温控系统原理
SLAN-48P采用半导体控温技术（Peltier效应），通过电流方向切换实现快速升温与降温。
温度精度：误差控制在±0.1℃。
孔间一致性：确保48孔各位置温度均匀，减少扩增差异。
梯度退火功能：可同时测试多个退火温度，用于引物优化。
2. 光学检测原理
SLAN-48P光学模块由激发光源、滤光片组与高灵敏光电探测器组成：
激发光源：发出特定波长光，激发荧光分子。
滤光系统：分离不同荧光信号，避免通道串扰。
探测器：将荧光信号转化为电信号，再由软件记录。
多通道设计允许在同一孔位检测多种荧光标记，实现多重扩增。
3. 数据采集与分析原理
扩增曲线生成：记录每循环荧光强度。
阈值设定：在指数扩增期设定阈值，计算Ct值。
定量方法：通过标准曲线或ΔΔCt计算样品浓度或相对表达水平。
五、Ct值与定量原理
1. Ct值定义
Ct值是指扩增曲线荧光信号超过阈值的循环数。Ct值与模板初始浓度成反比：模板越多，Ct值越小。
2. 定量方式
绝对定量：利用已知浓度标准品建立Ct值与拷贝数的标准曲线，推算未知样品浓度。
相对定量：常用于基因表达分析，通过比较目标基因与参考基因的Ct值差异，得出相对表达量。
六、熔解曲线分析原理
1. 基本机制
在扩增完成后逐步升高温度，使PCR产物逐渐解链。SYBR Green染料在双链DNA存在时发光，解链时荧光降低，形成熔解曲线。
2. 结果判定
单一尖锐峰：说明产物特异性好。
多峰或杂峰：提示存在非特异性扩增或引物二聚体。
峰值偏移：反映GC含量差异或体系不稳定。
3. 应用
验证扩增特异性。
区分基因型或突变。
七、信号处理与数据输出
1. 背景扣除
系统在前几个循环记录背景荧光，并在后续分析中自动扣除，提高检测灵敏度。
2. 曲线拟合
通过数学模型拟合扩增曲线，修正异常点，确保Ct值准确。
3. 报告生成
软件可自动生成Ct值表、扩增曲线图、熔解曲线和统计结果，并支持导出为Excel或PDF文件。
八、实验特点与应用价值
1. 技术优势
通量适中，灵活高效，适合常规实验。
光学与温控系统高度集成，结果稳定。
软件智能化，操作简便。
支持多重扩增和多通道检测。
2. 应用领域
临床检测：病原体核酸检测、遗传病突变筛查。
科研实验：基因表达谱分析、分子功能研究。
食品安全：转基因检测、致病菌筛查。
环境监测：污染源微生物检测。
九、实验注意事项
样本制备需避免降解，特别是RNA实验。
严格分区操作，避免扩增产物污染。
对照必须齐全，确保数据可解释。
试剂与耗材应符合设备推荐标准。
十、总结
宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P实验原理是PCR扩增循环、荧光信号检测与计算机数据分析的综合应用。其核心在于利用精准温控实现核酸扩增，依靠光学系统捕捉荧光变化，再通过Ct值与熔解曲线进行结果解读。SLAN-48P不仅在技术上保证了实验的高灵敏度和高准确性，还在应用层面兼顾科研与临床的多种需求。通过严格遵循实验原理并规范操作，研究者能够最大限度地发挥该设备的性能优势，为分子生物学和医学检测提供可靠的数据支持。
