一、实验原理与仪器简介
实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）是一种在核酸扩增过程中实时监测反应体系内荧光信号变化的技术。荧光信号强度与目标核酸扩增量成比例，通过软件绘制扩增曲线并计算循环阈值（Ct 值），可实现定性与定量分析。
博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪是一款小型化、多功能检测平台，具备以下特点：
16 孔设计，适合小批量实验和教学科研场景。
多通道荧光检测系统，可兼容 SYBR Green 法和探针法。
升降温速度快，温控均一性好，确保结果稳定。
配套软件支持多种分析模式，包括标准曲线法、相对定量法和熔解曲线分析。
掌握该仪器的标准实验流程，有助于保证结果的可靠性与实验的重复性。
二、实验前准备
1. 实验环境
保持实验室空气洁净，无强烈气流、粉尘和腐蚀性气体。
温度保持在 18–30℃，湿度建议 30–70%。
仪器应放置于平稳台面，避免震动与阳光直射。
2. 试剂与耗材
qPCR 反应试剂盒（含 Master Mix、荧光染料或探针）。
上下游引物（需根据目标基因设计）。
模板 DNA 或 RNA（RNA 需经反转录制备 cDNA）。
无核酸酶的超纯水。
适配 FQD-16A 的 PCR 管或八联管。
无 RNase/DNase 的枪头、移液器。
3. 样品准备
提取 DNA 或 RNA 时需严格避免降解。
检测 RNA 时，必须进行反转录步骤生成稳定的 cDNA。
样品浓度应在适合范围，过高或过低均会影响扩增曲线。
三、实验体系配置
以 20 μL 反应体系为例（常见 SYBR Green 体系）：
2× Master Mix：10 μL
上游引物（10 μM）：0.4 μL
下游引物（10 μM）：0.4 μL
模板：1–2 μL
ddH2O：补足至 20 μL
注意事项：
体系配制应在冰上进行，降低酶活性丧失与非特异扩增风险。
配制过程中避免产生气泡，可在离心机中瞬时离心。
每次实验需同时设置阴性对照（NTC）和阳性对照。
四、FQD-16A 实验流程
1. 仪器启动
打开主机电源，确认设备进入待机状态。
在电脑上启动配套软件，确保仪器与计算机连接正常。
2. 上样操作
打开仪器反应模块盖板。
将配置好的 PCR 管按孔位顺序插入反应模块。
检查管口密封性，避免蒸发影响扩增结果。
关闭盖板，确保紧密贴合。
3. 程序设置
在软件界面新建实验任务：
输入实验名称与保存路径。
设置循环程序，例如：
95℃，10 s
60℃，30 s（采集荧光），共 40 次
预变性：95℃，3 min
循环：
若采用熔解曲线分析，则需在最后增加：
65–95℃ 梯度升温，每步 0.5℃，实时采集荧光。
4. 荧光通道选择
SYBR Green 法选择 FAM 通道。
探针法根据探针染料选择 FAM、HEX、ROX 或 Cy5 通道。
多重检测时需在软件中逐一勾选通道并命名。
5. 实验运行
检查参数是否正确。
点击“运行”，仪器开始升降温和荧光检测。
实验全程无需人工干预，待反应完成后自动生成数据文件。
五、结果分析
1. 扩增曲线
阳性样本应呈典型的“S 型”曲线。
阈值线与曲线交点为 Ct 值。
阴性对照应无信号，若有曲线提示污染或非特异扩增。
2. 熔解曲线
单一尖锐峰代表扩增产物特异性强。
多峰或宽峰可能意味着引物二聚体或非特异扩增。
3. 定量计算
绝对定量：根据标准曲线 Ct 值与模板拷贝数关系计算样品浓度。
相对定量：使用 ΔCt 或 ΔΔCt 方法，通常以内参基因作为标准。
4. 数据导出
可将结果导出为 Excel、PDF、图片等多种格式。
推荐实验完成后立即备份，以便后续分析和发表。
六、常见问题与解决思路
无扩增曲线
检查模板和试剂是否加错或降解。
确认循环条件设置正确。
Ct 值偏大或不稳定
模板浓度过低或引物效率不足。
可优化引物或提高模板浓度。
熔解曲线出现多峰
引物设计不合理。
检查操作是否导致污染。
荧光信号弱或平台期不明显
样品存在抑制剂。
尝试稀释模板或更换提取方法。
七、日常维护与注意事项
维护
每次实验结束后，关闭电源并保持仪器干燥。
用无尘布轻轻擦拭反应模块，避免化学物质残留。
光学检测部分不得触碰或划伤。
操作规范
严格区分试剂准备区与产物分析区，减少污染风险。
上样与加样过程中应佩戴一次性手套。
使用过的管子应高压灭菌或按规定废弃。
定期备份实验数据。
建议建立实验日志，记录样品来源、体系配制细节及仪器运行情况。
八、综合总结
博日 FQD-16A 实时荧光定量 PCR 仪具有体积小巧、操作简便、检测灵敏度高等优点，非常适合科研教学及应用实验室开展分子检测工作。实验流程主要包括：
样品与试剂准备；
反应体系配置；
上机操作与程序设置；
荧光采集与扩增；
数据分析与结果导出。
掌握上述规范流程，不仅能够提高实验的准确性和重复性，还能帮助实验人员快速定位问题、保证检测结果的可靠性。
