博日荧光定量PCR仪FQD-96C实验流程
一、前言
荧光定量PCR（qPCR）技术是目前分子生物学研究与临床诊断中最常用的核酸定量方法。博日科技研发的FQD-96C荧光定量PCR仪，凭借高灵敏度光学通道、精确温控模块及稳定的软件系统，广泛应用于病原体检测、基因表达分析、突变筛查以及食品与环境安全监测。为了充分发挥该设备的性能并确保实验数据可靠，规范化的实验流程至关重要。本文将从实验准备、样本处理、反应体系配置、仪器操作、数据采集与分析、质量控制等多个环节，系统介绍FQD-96C的标准实验流程。
二、实验准备
1. 实验室环境
进行荧光定量PCR实验的实验室需具备以下条件：
洁净环境：避免气溶胶污染和交叉污染。
分区操作：设置试剂准备区、样本处理区与扩增检测区，物品不可混用。
温湿度适宜：室温保持稳定，避免强光直射和过度潮湿。
2. 仪器准备
在使用FQD-96C前需完成以下检查：
仪器电源和接地是否正常。
光学通道是否完成自检。
温控模块运行是否稳定。
软件是否处于可操作状态，数据库与用户权限设置正确。
3. 试剂与耗材准备
PCR预混液、酶、引物和探针需低温保存，使用前缓慢融解并轻轻混匀。
96孔PCR板或适配管需无DNA/RNA酶污染。
无核酸酶水作为稀释与对照使用。
三、样本处理
1. 样本采集
临床样本可来自血液、咽拭子、痰液、组织等；食品与环境样本可包括水体、农产品或加工食品。采集时应遵循无菌规范，并在短时间内转入实验室进行处理。
2. 核酸提取
采用商业化核酸提取试剂盒或自动提取仪。
确保RNA提取过程含有核酸酶抑制剂，避免降解。
提取完成后需检测浓度与纯度（260/280比值在1.8–2.0为佳）。
3. 模板保存
提取后的DNA或RNA需置于-20℃或-80℃保存，避免反复冻融，实验前需在冰上解冻并混匀。
四、反应体系配置
1. 体系组成
标准反应体系包括：
PCR反应缓冲液
dNTP混合物
MgCl₂（若已含于缓冲液中则可省略）
DNA聚合酶（耐热Taq酶或逆转录酶-Taq联合体系）
荧光探针或染料（如SYBR Green）
特异性引物对
模板DNA/RNA
无模板对照（NTC）
2. 配制步骤
在低温条件下操作，避免试剂降解。
严格按照实验设计加入各组分，使用移液枪避免误差。
每个样品至少设3个重复孔，以保证数据可靠性。
3. 反应体系体积
常规反应体系为20μL或25μL，可根据试剂盒说明进行调整。
五、实验操作流程
1. 样品加样
将反应液分装至96孔板中。
使用光学封板膜封口，避免蒸发与污染。
离心片刻使液体均匀分布，避免气泡影响光学检测。
2. PCR仪设置
在FQD-96C软件界面中进行以下操作：
程序编辑：输入变性、退火、延伸温度与循环次数。
荧光通道选择：根据所用探针/染料选择对应检测通道。
样本命名：输入样品编号、分组信息及对照设置。
3. 反应运行
启动扩增程序，仪器将自动完成温控与荧光信号采集。
扩增过程中可实时查看扩增曲线。
六、数据采集与分析
1. 扩增曲线
软件会根据荧光信号绘制实时扩增曲线。正常曲线呈现典型的S型，指数期信号上升明显。
2. Ct值计算
系统自动计算循环阈值（Ct），Ct值与初始模板量呈负相关。低拷贝样本Ct值较高，高拷贝样本Ct值较低。
3. 标准曲线
在绝对定量实验中，需使用已知浓度标准品绘制标准曲线。FQD-96C能自动生成曲线，并提供斜率、截距和相关系数（R²）。
4. 熔解曲线分析
使用SYBR Green染料时，熔解曲线有助于判断扩增特异性。单一峰值表示扩增特异性良好，多峰值提示可能存在非特异产物或引物二聚体。
5. 多重检测结果
对于多通道实验，软件可分别输出各通道信号，用户可直观对比不同基因靶点的扩增情况。
七、质量控制与注意事项
1. 对照设置
无模板对照（NTC）：排除污染可能。
阳性对照：验证体系与操作是否正确。
内参基因：用于归一化数据，消除样本间差异。
2. 重复性
同一样本设多孔重复，确保Ct值差异在合理范围内。
3. 防污染措施
分区操作，试剂与样本分开处理。
使用滤芯枪头，避免气溶胶污染。
定期对仪器进行清洁与紫外灭菌。
八、常见问题及解决方案
无扩增曲线：可能因模板质量差、引物设计不当或反应体系配置错误。
Ct值偏高：模板量不足或存在抑制剂，可通过优化提取方法解决。
重复性差：移液误差或反应孔封膜不严。
非特异扩增：需优化引物设计或退火温度。
九、实验流程的应用价值
1. 临床诊断
标准化的实验流程确保了病原体核酸检测的可靠性，减少误诊与漏诊。
2. 科研研究
规范化操作有助于结果的可重复性和跨实验室比较，提升研究可信度。
3. 食品与环境监测
在大规模筛查中，稳定流程能提高检测效率和准确性，为公共安全提供保障。
十、结论
博日FQD-96C荧光定量PCR仪通过高性能硬件和智能化软件设计，为核酸检测提供了可靠平台。而严格规范的实验流程，则是确保其性能优势得以发挥的关键。从样本准备到结果分析，每一步操作都需要科学、严谨与规范。只有在标准化流程的基础上，才能保证检测灵敏度、特异性和可重复性，满足临床诊断、科研探索及食品环境安全等多领域的应用需求。
