宏石荧光定量PCR仪SLAN-96R实验步骤详解
一、实验概述
宏石荧光定量PCR仪SLAN-96R是一款高性能的实时荧光定量PCR系统，广泛应用于分子诊断、基因研究、病原体检测和药物研发等领域。为了获得稳定、准确的实验结果，必须遵循标准化的实验步骤。本教程从实验前准备到数据分析，完整梳理SLAN-96R的实验操作流程。
二、实验前准备
1. 实验环境
温湿度要求：温度保持在18–30℃，湿度30%–80%。
台面条件：台面稳固、防震，避免磁场和电磁干扰。
清洁要求：实验区应定期清洁，避免灰尘、气溶胶污染。
2. 仪器检查
确认SLAN-96R电源线、通信线连接牢固。
检查样品仓是否清洁，无液体残留。
打开电源，观察自检状态是否正常。
3. 试剂与耗材
耗材：96孔反应板或八联管，光学封板膜。
试剂：PCR预混液、dNTP、Taq酶、引物、探针/荧光染料。
样品：提取的DNA或RNA（RNA需先反转录）。
4. 对照准备
阴性对照：不含模板，仅含体系。
阳性对照：含已知浓度模板，用于判断实验体系有效性。
三、反应体系配置
1. 配制步骤
在洁净区内操作，穿戴防护服、手套。
使用移液器准确加入各组分：缓冲液、引物、探针、酶、模板。
最终体系体积常见为20µL或25µL。
2. 注意事项
加样前需轻轻混匀，避免剧烈震荡。
使用新鲜吸头，避免交叉污染。
设置至少三个重复孔，提高数据可靠性。
3. 离心处理
配置完成后，将反应板放入离心机，短暂离心5–10秒。
通过离心消除气泡，使液体沉底。
四、软件设置与实验启动
1. 新建实验
打开配套软件，点击“新建实验”。
输入实验名称、保存路径，便于后续数据管理。
2. 程序参数设定
初始变性：95℃，2–5分钟。
循环阶段：
变性：95℃，10–15秒；
退火：55–65℃，20–30秒；
延伸：72℃，20–30秒。
循环次数：35–45次，视实验需求而定。
采集点一般设在退火或延伸阶段。
3. 荧光通道选择
支持FAM、HEX、ROX、CY5等通道。
若进行多重检测，需为不同靶标分配独立通道。
4. 样品布局
在96孔板界面中输入样品编号。
指定每个孔位的实验组别和对照类型。
用颜色标注不同样品，方便区分。
5. 装载样品
将反应板放入SLAN-96R样品仓。
确认放置方向与仪器标识一致。
关闭舱盖，确保密封良好。
6. 启动实验
点击“开始运行”。
仪器自动执行加热循环并采集荧光信号。
五、实验运行与监控
1. 实时扩增曲线
软件界面显示曲线逐渐上升。
指标：对照孔状态正常，曲线呈指数型。
2. 温度曲线监控
仪器显示每个循环的温度变化。
若控温异常，实验需暂停检查。
3. 状态提示
状态栏提示实验进度和剩余时间。
出现异常时，系统自动报警。
六、实验结束与数据分析
1. 扩增曲线解读
阴性对照：应无信号。
阳性对照：Ct值应在合理范围内。
样品曲线：呈典型S型，表明扩增成功。
2. Ct值计算
软件自动识别阈值线并计算Ct值。
用户可手动调整阈值线，以优化分析。
3. 标准曲线
输入标准品浓度，绘制标准曲线。
相关系数R²应≥0.98。
PCR效率在90%–110%为理想范围。
4. 熔解曲线
检查产物特异性。
单一峰值表明特异性良好；多峰提示存在非特异扩增。
5. 数据导出
支持Excel、PDF、Word、图像格式。
导出的文件包含Ct值表格、扩增曲线、熔解曲线等。
七、常见问题与处理
1. Ct值过高或无扩增
模板浓度过低，需提高输入量。
检查引物设计与试剂有效性。
2. 非特异性扩增
提高退火温度，优化反应条件。
重新设计引物或探针。
3. 重复性差
加样体积不一致。
存在气泡或封膜不严。
4. 软件连接异常
检查通信线缆。
关闭软件与仪器电源后重新启动。
八、维护与保养
1. 实验后处理
取出反应板，清理样品仓。
使用无水乙醇擦拭光学窗口。
2. 日常维护
定期检查电源与散热系统。
保持仪器外部清洁，防止灰尘积聚。
3. 定期校准
按厂家要求进行光学系统和温控校准。
保证长期使用的稳定性和准确性。
4. 长期停机
切断电源，覆盖防尘布。
存放在干燥、通风环境中。
九、应用拓展
SLAN-96R实验步骤不仅适用于常规基因检测，还可拓展至：
病原体检测：病毒、细菌核酸快速检测。
遗传病研究：突变筛查、基因分型。
肿瘤检测：突变位点与融合基因分析。
药物研发：基因表达定量、药效评估。
食品安全：转基因成分和致病菌检测。
十、总结
宏石荧光定量PCR仪SLAN-96R的实验步骤涵盖准备、配置、运行、分析与维护五大环节。每一步都直接关系到实验结果的准确性与可靠性。只有在严格遵循规范操作的前提下，才能保证Ct值计算合理、扩增曲线清晰、熔解曲线特异，从而在临床诊断、科研实验和教学培训中充分发挥其应用价值。
