宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P操作流程
一、引言
实时荧光定量PCR（qPCR）是现代分子生物学和临床检验中应用最广泛的技术之一。它通过在扩增过程中实时监测荧光信号，判断核酸的存在和数量，从而实现对基因的定性与定量分析。宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P是一款中通量核酸检测设备，能够同时检测48个样品，广泛应用于临床病原体检测、肿瘤相关基因研究、食品转基因成分分析以及环境微生物监测。
为了充分发挥SLAN-48P的性能，实验人员必须严格遵循标准化的操作流程。本资料旨在系统性介绍从实验准备到数据分析的全过程，为科研和临床检测提供可靠参考。
二、操作流程框架
SLAN-48P操作流程可以概括为以下七大环节：
实验前准备
样品提取与核酸检测前处理
PCR反应体系配置
加样与反应板封装
仪器设定与扩增运行
数据采集与结果分析
实验结束与维护保养
这七个环节相辅相成，环环相扣，保证实验的完整性和准确性。
三、实验前准备
1. 实验环境
实验室应按照分区原则进行布局：核酸提取区、反应体系配置区和扩增检测区应相互独立。
室温保持在18–30℃，相对湿度40–70%。
使用紫外灯照射或75%酒精擦拭工作台，降低气溶胶污染风险。
2. 仪器检查
确认电源和通信接口连接良好。
检查样品仓和光学窗口，确保无灰尘、液滴或残留物。
打开仪器电源，观察自检状态是否正常。
3. 软件准备
启动配套软件，检查是否为最新版。
新建实验文件夹，填写实验名称、日期、实验人员等信息。
四、样品提取与前处理
1. 样品类型
血液、组织、细胞、拭子、食品或环境样本均可作为实验对象。
2. 核酸提取
使用标准试剂盒提取DNA或RNA。
RNA样本需进行反转录，转化为cDNA作为模板。
3. 样品质量检测
使用分光光度计检测核酸浓度与纯度。
A260/A280比值在1.8–2.0之间为合格。
浓度过低的样本可进行浓缩处理。
五、反应体系配置
1. 基础体系组成
PCR缓冲液
dNTP混合液
Mg²⁺溶液
特异性引物与探针
热稳定DNA聚合酶
模板核酸
2. 配置原则
每孔反应体积控制在20–25 μL。
建议先配制主混合液，再分装至各反应孔，最后加入模板。
对照设置包括阳性对照、阴性对照和无模板对照。
3. 注意事项
配置时需在洁净台中操作，避免RNAse或DNAse污染。
试剂应低温保存，避免反复冻融。
六、加样与反应板封装
1. 加样要求
使用无酶吸头和多道移液器，提高操作一致性。
避免加样过程中产生气泡。
2. 封板步骤
使用光学透明膜封口，保证密封严实。
使用压膜器确保贴膜平整无褶皱。
封板后轻轻离心，使反应液体集中于孔底。
七、仪器设定与运行
1. 温度程序设定
初始变性：95℃，2–3分钟。
循环步骤：
变性：95℃，10秒
退火/延伸：55–65℃，30秒
共40–45循环
2. 荧光通道设置
常见通道包括FAM、HEX/VIC、ROX、Cy5。
根据试剂选择正确通道，确保目标基因与内参基因分属不同通道。
3. 实验启动
将反应板放入样品仓，确保位置正确。
关闭仓盖，点击运行。
实验过程中可实时监控扩增曲线。
八、数据采集与结果分析
1. 扩增曲线
标准曲线应呈“S”型，包括基线期、指数期和平台期。
异常曲线需结合对照组判断问题来源。
2. Ct值计算
Ct值是荧光信号达到阈值时的循环数。
Ct值小表示模板量大。
同一样本重复孔之间Ct差异不应大于0.5。
3. 标准曲线分析
通过系列稀释标准品建立Ct值与对数浓度的关系。
理想斜率约 -3.3，扩增效率接近100%。
R² 大于0.99说明线性良好。
4. 融解曲线
适用于SYBR Green体系，用于验证扩增特异性。
单一峰代表特异扩增，多峰提示可能存在引物二聚体或非特异性产物。
5. 报告生成
软件可自动生成实验报告，包括Ct值表格、扩增曲线、标准曲线和融解曲线。
数据可导出为Excel、PDF等格式，方便归档。
九、实验结束与维护
1. 仪器清洁
实验结束后关闭电源。
用无水乙醇擦拭外壳。
清理样品仓，保持干燥。
2. 数据管理
分类存储实验数据，定期备份至服务器。
实验报告应存档，便于溯源。
3. 定期维护
定期对温控系统和光学系统进行校准。
使用标准品检测仪器性能。
十、常见问题与解决方案
无扩增曲线
检查模板浓度和引物设计。
确认酶是否失活。
Ct值偏高
模板量不足或降解。
阈值设置不合理。
重复性差
加样不均匀。
板膜封合不严，造成蒸发。
曲线异常
光学窗口受污染。
封板存在气泡。
十一、总结
宏石荧光定量PCR仪SLAN-48P操作流程涵盖了从样品处理到数据分析的完整路径。
在实验前准备阶段，应注重环境与仪器检查。
在反应体系配置与加样阶段，应严格比例与标准操作，避免污染。
在仪器运行阶段，应合理设定温控循环和荧光通道。
在数据分析阶段，应结合扩增曲线、Ct值、标准曲线与融解曲线综合判断。
在实验结束后，应做好仪器清洁、数据备份和定期校准。
通过严格遵循操作流程，SLAN-48P能够在临床诊断和科研应用中提供高质量的检测结果，确保实验的科学性和可重复性。
